Бактериологические методы диагностики туберкулеза.

В последние годы для ускорения роста микобактерий предложены питательные среды на агаровой основе с различными ростовыми добавками и применением специальной газовой смеси.

1. Система BACTEC относится к разработкам высоких технологий и предназначена для ускоренной бактериологической диагностики туберкулёза и определения чувствительности микобактерий к препаратам первого ряда и некоторым препаратам второго ряда. Культивируют микроорганизмы в специальных пробирках с жидкой питательной средой на основе модифицированной среды Middlebrook. В её основе лежит флюоресценция, возникающая при потреблении кислорода микобактериями в процессе роста. Кислородзависимыйфлюорохромный краситель содержится на дне специальной пробирки и покрыт слоем силикона. Размножение микобактерий приводит к уменьшению количества кислорода в пробирке и снижению его концентрации, что вызывает усиление флюоресценции, которая становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым свете и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор ВАСТЕС- 960. Интенсивность свечения регистрируют в единицах роста (GU— growthunits). Данные роста заносятся в компьютер, где их можно сохранить, автоматически. Компьютерный анализ кривых роста может дать информацию о наличии различных пулов микобактерий, в том числе нетуберкулезных, а также помогает оценить ростовые свойства микобактерий. В результате внедрения таких систем время появления роста микобактерий значительно сократилось, составляя в среднем 11 - 19 дней, против 30-60 дней на стандартной плотной питательной среде. Необходимо отметить, что эти системы требуют высокой квалификации персонала.

2. Посев материала на жидкие среды обязательно сопровождают посевом на среду Левенштейна-Йенсена, играющую роль дублёра в тех случаях, когда на других средах микобактерий туберкулеза не дают роста.

3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет проводить прямое определение микроорганизмов непосредственно в клиническом материале без получения чистой культуры возбудителя. ПЦР - диагностика туберкулеза как правило строится на использовании последовательностей ДНК специфичных для всех видов группы туберкулеза. В основе принципа работы всех молекулярных биочипов с иммобилизованными зондами лежит способность биологических макромолекул к молекулярному узнаванию (высокоспецифичному избирательному связыванию с другими молекулами). На матрице расположено около 100 ячеек в которых содержится вещество позволяющее определить наличие определенного участка ДНК. При нанесении материала, содержащего участки ДНК способные связаться с материалом ячейки биочипа, после соответствующей обработки, появляется флюоресцентное свечение. Интенсивности флуоресценции из ячеек измеряются с помощью люминесцентного микроскопа, передающего сигнал на прибор с зарядовой связью. После этого данные подвергаются компьютерной обработке.

4. Лазерная флюоресцентная диагностика туберкулёза. Метод лазерно-флуоресцентной диагностики основан на анализе спектров поглощения и флюоресценции биосубстратов. При облучении биосубстрата с длинной волны 633 нм основным флюорохромом являются порфирины и порфириносодержащие соединения плазмы крови и порфирины бактерий. Диагностика различных форм туберкулеза производится путем анализа спектра и уровня интегральной флюоресценции плазмы крови и других биосубстратов больных. Метод эффективен для диагностики различных форм туберкулеза, в том числе на ранних стадиях. ЛФД позволяет вести мониторинг и коррекцию лечения в режиме реального времени. Мониторинг с применением флюоресцентного анализа позволяет выявить лекарственную устойчивость микобактерий туберкулеза на начальных этапах химиотерапии. Использование антигенов специфических для Micobacteriumtuberculosis является одним из направлений оптимизации диагностики туберкулеза в современных условиях. Геном человека содержит более 100 тыс. генов и 300 тыс. аллелей. Геном микобактерии содержит более 4 тыс. генов. Расшифровка геномов разных видов микобактерий позволили выделить у Micobacteriumtuberculosis область генома, которая отсутствует у Micobacteriumbovis BCG и большинства других видов нетуберкулезных микобактерий. В этой области Micobacteriumtuberculosis кодирует синтез двух секреторных белков ESAT-6 и CFP-10. Кроме того, на моделях зараженных туберкулезом животных установлено, что экспрессия белков ESAT-6 и CFP-10 связана именно с процессом размножения Micobacteriumtuberculosis

 

30. Туберкулинодиагностика(определение, ее виды, виды туберкулина).

Туберкулинодиагностика — диагностический тест для определения специфическойсенсибилизации организма к микобактериям туберкулеза (МБТ). Как специфический тестприменяется при массовых обследованиях населения на туберкулез (массовая туберкулинодиагностика) и для индивидуальных обследований (индивидуальная туберкулинодиагностика).

Цели массовой туберкулинодиагностики:
-выявление лиц впервые инфицированных МБТ («вираж» туберкулиновых проб);
-выявление лиц с гиперергическими и усиливающимися реакциями на туберкулин;
-отбор контингентов для противотуберкулезной прививки вакциной БЦЖ-М детей ввозрасте 2 месяцев и старше, не получивших прививку в роддоме, и для ревакцинациивакциной БЦЖ;
-ранняя диагностика туберкулеза у детей и подростков;
-определение эпидемиологических показателей по туберкулезу (инфицированностьнаселения МБТ, ежегодный риск инфицирования МБТ).

При массовой туберкулинодиагностике применяют только единую внутрикожнуютуберкулиновую пробу Манту с 2 туберкулиновыми единицами (ТЕ) очищенноготуберкулина в стандартном разведении (готовая форма).

Цели индивидуальной туберкулинодиагностики:
• дифференциальная диагностика поствакцинальной и инфекционной аллергиик туберкулину;
• диагностика и дифференциальная диагностика туберкулеза и других заболеваний;
• определение «порога» индивидуальной чувствительности к туберкулину;
• определение активности туберкулезного процесса;
• оценка эффективности противотуберкулезного лечения.

При индивидуальной туберкулинодиагностике применяют, кроме пробы Манту с 2 ТЕочищенного туберкулина в стандартном разведении, пробы Манту с различными дозамитуберкулина, накожная градуированная проба Пирке, проба Коха, определениетуберкулинового титра и др. Для проведения индивидуальной туберкулинодиагностикииспользуют: очищенный туберкулин в стандартном разведении и сухой очищенный туберкулин.

 Очищенныйтуберкулин (ППД) - purified protein derivative(PPD)

Изготавливают из смеси убитых нагреванием фильтратов культуры МБТ человеческого ибычьего видов, очищенных ультрафильтрацией, осажденных трихлоруксусной кислотой,обработанных этиловым спиртом и эфиром. Используют два вида очищенного туберкулина:

1. Аллерген туберкулезный очищенный жидкий (очищенный туберкулин в стандартномразведении) - готовые к употреблению растворы туберкулина. Препарат представляетсобой раствор очищенного туберкулина в фосфатном буфере с твином-80 в качествестабилизатора и фенолом в качестве консерванта, бесцветная прозрачная жидкость.Препарат выпускают в ампулах в виде раствора, содержащего 2 ТЕ ППД-Л в 0,1 мл.Возможен выпуск 5 ТЕ, 10 ТЕ в 0,1 мл и других дозировок препарата. Срок годности -1 год.Выпуск готовых к употреблению разведений ППД-Л (модификация Линниковой) позволяетиспользовать в стране для массовой туберкулинодиагностики стандартный по активностипрепарат и избежать ошибок при разведении туберкулина на местах его применения.

2. Аллерген туберкулезный очищенный сухой (сухой очищенный туберкулин) — эторастворенный в фосфатном буфере с сахарозой лиофильно высушенный очищенныйтуберкулин. Препарат имеет вид сухой компактной массы или порошка белого (слегкасероватого или кремового) цвета, легко растворяющегося в прилагаемом растворителе -карболизированном изотоническом растворе натрия хлорида. Выпускается в ампулах,содержащих 50 000 ТЕ. Срок годности - 5лет.Сухой очищенный туберкулин используют для диагностики туберкулеза итуберкулинотерапии только в противотуберкулезных диспансерах и стационарах.

Препараты для выявления антител к микобактериям туберкулеза

Диагностикумэритроцитарный туберкулезный антигенный сухой — бараньи эритроциты,сенсибилизирорванныефосфатидным антигеном МБТ, пористая масса или порошоккрасновато-коричневого цвета. Предназначен для выявления в реакции непрямойгемагглютинации (РНГА) специфических антител к антигенам МБТ. В клинике туберкулезаиспользуют как иммунологический тест для определения активности процесса и эффективности лечения.

Тест-система иммуноферментная для определения антител квозбудителю туберкулеза. Представляет собой набор ингредиентов для проведенияиммуноферментного анализа на твердофазном носителе. Предназначена для выявленияантител к возбудителю туберкулеза в сыворотке крови больных. Используют длялабораторного подтверждения диагноза туберкулез различной локализации, оценкиэффективности лечения, назначения специфическойиммунокоррекции. Чувствительность иммуноферментного анализа при туберкулезесоставляет 60-70%, а специфичность около 90%, что не позволяет использовать тест-систему для скрининга туберкулезной инфекции

 

31. Проба Манту с 2 ТЕ, цели и подготовка к проведению.

Манту с 2 ТЕ проводят с целью раннего и своевременного выявления больных тубом и лиц с повышенным риском заболевания тубом среди детей и подростков, для отбора контингентов, подлежащих ревакцинации БЦЖ, и для определения инфицированности населения МБТ.

Детям и подросткам проба Манту проводится ежегодно, начиная с 12 месяцев, независимо от результатов предыдущей пробы.

Пробу Манту по назначению врача ставит специально обученная медицинская сестра или фельдшер, имеющие документ-допуск к проведению туберкулинодиагностики.

Для постановки пробы Манту необходимо применять однограммовые туберкулиновые шприцы. Для каждого обследуемого используют отдельные стерильные шприц и иглу.

Ампулу с туберкулином обтирают марлей, смоченной 700 этиловым спиртом, шейку ампулы надпиливают и отламывают. В шприц набирают 0,2 мл туберкулина, насаживают тонкую короткую иглу и выпускают из шприца 0,1 мл раствора с тем, чтобы объем вводимого препарата составил 0,1 мл (2 ТЕ).Пробу Манту ставят следующим образом. На внутренней поверхности средней трети предплечья участок кожи обрабатывают 700 этиловым спиртом и просушивают ватой. Иглу срезом вверх вводят в верхние слои кожи параллельно ее поверхности и впрыскивают 0,1 мл раствора туберкулина, т.е. одну дозу. При правильной технике проведения пробы в коже образуется папула беловатого цвета 7-8 мм в диаметре.