Спектрофотометрические методы

Количественное определение ампициллина спек- трофотометрическим методом основано на том, что ампициллин при нагревании в растворе CuS04 обра- зует окрашенный комплекс. Точную навеску образца антибиотика растворяют в буферном растворе суль- фата меди и выдерживают на водяной бане при 80°C 30 мин., затем быстро охлаждают. Оптическую плот- ность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 320 нм, используя в качестве раствора сравнения непрогретый буферный раствор препарата. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца ампициллина, обра-

 

Иммунологические методы

Иммунологические методы основаны на исполь- зовании специфических антител, поэтому требуют длительной предварительной подготовки (получения антител путем иммунизации животных определен- ным антибиотиком). Вторым компонентом реакции является меченый препарат, аналогичный определя- емому. Метка может быть радиоактивной, флуорес- цирующей или ферментной, определяющей способ регистрации результатов анализа. Результат зависит от конкурентного связывания с антителами испыту- емого препарата и меченого аналога: чем больше ко- личество испытуемого препарата присутствует в сме- си, тем меньшее количество меченого аналога будет связано с антителами. Антитела фиксируют в лунках планшета, куда последовательно вносят испытуемый раствор и тест-систему (меченый аналог и необходи- мый реагент-детектор). Достоинством иммунологи- ческих методов является их высокая специфичность и чувствительность.

Глава 14. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

 

Избирательность действия антимикробных пре- паратов связана со структурными и метаболическими различиями клеток микро- и макроорганизма. Химио- терапевтический препарат действует на определенный участок системы метаболизма микробной клетки, ко- торый является его мишенью. Такими мишенями мо- гут быть отдельные участки синтеза клеточной стенки, белка, нуклеиновых клеток и т. д.

Ингибиторы биосинтеза компонентов клеточной стенки

Биосинтез пептидогликана

Пептидогликан (муреин) является важнейшей структурой клеточной стенки бактерий, поэтому на- рушение его биосинтеза некоторыми антибиотиками приводит к гибели микроорганизма или прекращению размножения клеток. Структура, подобная пептидо- гликану, отсутствует в клетках млекопитающих, что обеспечивает избирательность действия антибиотика. Молекула пептидогликана состоит из линейных цепей чередующихся единиц N-ацетилмурамовой кисло- ты и N-ацетилглюкозамина, связанных поперечными пептидными мостиками. Предшественники пепти- догликана синтезируются в цитоплазме, собираются на молекуле липида-носителя, на цитоплазматической мембране и на первом этапе включаются в клеточную стенку, образуя цепи гликана без поперечных сшивок. На втором этапе эти цепи сшиваются с ранее образо- ванным пептидогликаном с помощью фермента, лока- лизованного на внешней стороне цитоплазматической мембраны. Эти этапы биосинтеза пептидогликана существуют у всех грамположительных и грамотри- цательных бактерий, межвидовые различия могут ка- саться некоторых деталей, в частности, состава амино- кислот в пептидных мостиках.

Подробно процесс изучен у Escherichia coli. Пред- шественники пептидогликана — N-ацетилглюкозамин и N-ацетилмурамилпентапептид синтезируются в ци- топлазме, каждый из них связан с молекулой носи- теля — уридиндифосфата (УДФ), обеспечивающего энергией реакции синтеза. Пентапептид, соединенный с N-ацетилмурамовой кислотой, содержит L-аланин, D-глутаминовую кислоту, мезо-диаминопимелиновую

кислоту и два остатка D-аланина на С-конце пептида. Липидноситель — это высоколипофильный ундекапре- нилафосфат, который располагается в цитоплазматиче- ской мембране и действует как акцептор предшествен- ников пептидогликана на ее внутренней поверхности. N-ацетилмурамилпентапептид и N-ацетилглюкозамин последовательно переходят от своего УДФ-носителя на липидноситель с освобождением уридинмонофос- фата (УМФ) и УДФ, соответственно, и образовани- ем β -1,4-гликозидной связи. Дисахаридпентапептид присоединяется к липидоносителю пирофосфатной связью. В этой форме он транслоцируется через цито- плазматическую мембрану и присоединяется к суще- ствующему пептидогликану клеточной стенки в зоне ее роста. Соответствующий генетический контроль обеспечивает сохранение характерной формы клетки за счет присоединения вновь синтезированных эле- ментов в определенном локусе.

Предполагают, что линейный гликан, присоеди- ненный к другой молекуле липидоносителя, служит в клеточной стенке местом связывания вновь транс- лоцированного дисахаридпентапептида. Линейный гликан соединяется с ним с образованием гликозидной связи между остатком N-ацетилмурамовой кислоты гликана и N-ацетилглюкозамина вновь транслоциро- ванного дисахаридпентапептида. Реакция трансглико- зилирования приводит к увеличению линейного гли- кана на одну дисахаридную единицу и освобождению липида-носителя в форме пирофосфата. Носитель утрачивает одну молекулу фосфата под действием пи- рофосфорилазы и возвращается в цикл транслокации дисахаридпентапептида из цитоплазмы к клеточной стенке.

В клеточной стенке происходит образование по- перечной сшивки. Вновь синтезированный линейный гликан присоединяется к пептидогликану стенки пу- тем образования пептидных связей. Эту функцию вы- полняют транспептидазы (ТПазы), расположенные на внешней части цитоплазматической мембраны. Вначале ТПазы связываются с остатком D-аланил- D-аланина пентапептида в линейном гликане. Пеп- тидаза отщепляет терминальный D-аланин, а ТПаза соединяется с С-концом оставшегося D-аланина, об- разуя активный интермедиат. Следующая стадия ре-

акции транспептидирования заключается в переносе ацильной группы терминального остатка D-аланина к акцепторной аминогруппе диаминопимелиновой кислоты ближайшей цепи пептидогликана. Новая пеп- тидная связь образуется между карбоксильной груп- пой D-аланина вновь синтезированной цепи гликана и аминогруппой диаминопимелиновой кислоты суще- ствующего пептидогликана, а ТПаза освобождается. Предполагается, что энергия, освобождающаяся при разрыве связи D-аланил-D-аланин используется для реакции образования пептидной сшивки.

Пептидогликан Е. coli и многих бацилл имеет лишь 20-30% поперечных сшивок. Однако все свобод- ные пептиды, соединенные N-ацетилмурамовой кис- лотой, являются тетрапептидами, благодаря действию D, D-Kapбокcиnenтидазы (КПазы), которая подобно ТПазе, отщепляет терминальный D-аланин без обра- зования поперечной сшивки. Помимо этих ферментов в синтезе пептидогликана участвует эндопептидаза, которая расщепляет пептидные сшивки, возможно, создавая локусы для присоединения новых цепей пеп- тидогликана; трансгликозилаза присоединяет к пепти- догликану новые цепи гликана, которые затем сшива- ются поперечными связями с помощью ТПазы.