Методические указания к лабораторным работам

№1: Определение активности ЛДГ в тканях или сыворотки крови.

№2: Обнаружение молочной кислоты в мышечной ткани.

 

Работа № 1. Определение активности ЛДГ в сыворотке крови.

Принцип метода  основан на определении скорости снижения реакции катализируемой ЛДГ. Спектрофотометрическое определение оптической плотности при окислении НАДН₂  в НАД+ проводят при длине волны 340 нм (тест-Варбурга).

ПВК + НАД·Н + Н+ ← лактатдегидрогеназа → МК + НАД+

Скорость падения Е (оптической плотности) пропорциональна снижению концентрации НАДН и активности ЛДГ.

Ход работы: Настроить спектрофотометр на длину волны 340 нм. В чистую пробирку внести ниже перечисленные реактивы, затем перелить их в кювету спектрофотометра и через 30 секунд снимать показания прибора начиная с Ео через каждую минуту, в течение 3 минут.

Реактивы реакционной смеси:

1. Фосфатный буфер - 2,5 мл.

2. Сыворотка крови - 0,1 мл.

3. Р – р. НАДН       - 0,1 мл.

4. Р. – р. ПВК          - 0,1 мл.

     

 

Расчет:    

Из полученных в ходе измерений трех DЕс (экстинций), найти среднее значение (DЕ/мин.), которое умножить на коэффициент пересчета в международные единицы (U/л) – 8095.

U/л = 8095 х DЕ/мин.

Если полученный результат разделить на 16,67, то получим результат в нмоль/л.

В норме активность ЛДГ в сыворотке крови, замеренная при комнатной температуре, находится в пределах 120 – 240 U/л.

Работа № 2. Определение содержания молочной кислоты в сыворотке крови.

Принцип метода: Определение молочной кислоты основано на реакции катализируемой ЛДГ (см. выше) и тесте-Варбурга – спектрофотометрической регистрации прироста НАДН при длине волны 340 нм, эквимолярному окисленной молочной кислоте.

Ход работы:

1.Этап. Получение безбелкового экстракта молочной кислоты.

В центрифужную пробирку отмерить 0,5 мл. крови (сыворотки) и 1 мл 0,6 М хлорной кислоты. Через 5 мин. инкубации осадить белки центрифугированием при 5 тыс.об/мин., в течение 5 минут. Полученную надосадочную жидкость слить в чистую пробирку и использовать для исследования в следующем этапе.

 2.Этап. Запуск реакции и инкубирование. 

Приготовить реакционную смесь (табл. 4)

Таблица 4. Приготовление реакционной смеси

Реагенты (мл).	Пробирки
	Опыт	Контроль
Буферный раствор	2,0	2,0
Хлорный экстракт	0,2	-
Р – р. НАД	0,1	0,1
Р – р. хлорной кислоты	-	0,2

 

Инкубирование провести в термостате при 39 градусах, в течение 30 минут.

3.Этап. Спектрофотометрирование.

Содержимое пробирок опыта и контроля поочередно перелить в чистые кюветы и снять показания экстинций с прибора при длине волны 340 нм., против воздуха.

4.Этап. Расчет: Еоп – Ек = DЕ

С ммоль/л = DЕ х 10535, где 10535 – коэффициент пересчета в ммоль/л.

В нормальной венозной сыворотке крови содержание молочной кислоты находится в пределах – 0,6 – 1,6 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение: Определение активности ЛДГ и содержания молочной кислоты в сыворотке крови широко используется в клинической практике для характеристики функционального состояния гликолиза, тканевого дыхания и проницаемости клеточных мембран. Так при снижении или полном прекращении поступления кислорода в ткани, при ингибировании или структурном повреждении ферментов тканевого дыхания происходит повышение обоих биохимических показателей. Однако при большинстве патологических состояний повышенная активность гликолиза и проницаемость мембран сочетаются и это приводит к более резкому увеличению концентрации МК и активности ЛДГ, например, при воспалительных процессах в почках, мышцах, ишемии тканей и т.д.

Существуют патологические состояния, когда наоборот, активность гликолиза снижается - при гипогликемических состояниях, дефиците регуляторных факторов, стимулирующих гликолиз или при его ингибировании.

ЛЕКЦИЯ № 2

Тема: Катаболизм глюкозы. Гликолиз.