Відомі також антибіотичні речовини, вироблювані вищими рослинами (фітонциди) і тваринними організмами.

Фітонциди

Це речовини, які виділяються вищими рослинами і володіють антимікробною дією. Вони різняться за хімічною природою й силою дії. Одні з них викликають загибель мікроорганізмів, інші лише пригнічують їх розвиток. Фітонциди володіють вибірковістю: кожен діє тільки на певні мікроорганізми. Ефект дії залежить від часу, умов і стійкості мікроорганізму.

Деякі фітонциди застосовуються в медичній практиці. Ведуться дослідження по вивченню можливості застосування фітонцидів з метою збільшення строків зберігання харчових продуктів, що швидко псуються.

Мікробіологічні методи дослідження чутливості мікроорганізмів доантимікробних препаратів

Для визначення чутливості мікроорганізмів до антисептичних препаратів найчастіше використовують методи засновані на явищі дифузії антимікробної речовини в агар до них належать наступні методи:

паперових дисків,

циліндрів,

лунок в товщі агару,

радіальних штрихів.

Першим етапом для трьох перших методів є виконання посіву тестової культури на щільне поживне середовище однорідним шаром. Дані методи дозволяють проводити оцінку чутливості досліджуваної культури одразу до декількох антисептичних препаратів.

Метод паперових дисків полягає у дифузії в агар антибіотиків зі стандартних паперових дисків, які просочені певним антибіотиком в чітко визначеній концентрації. Такі диски встановлюються на щільне поживне середовище з попередньо засіяною культурою рівномірно на відстані від краю чашки Петрі близько 20 мм та на такій же відстані один від одного. В одній чашці можна встановлювати диски з різними препаратами або з різними концентраціями однієї досліджуваної речовини.

Метод циліндрів відрізняється від попереднього тим, що на поживне середовище із засіяною рівномірним «газоном» культурою встановлюють за допомогою пінцета стерильні фарфорові, металеві чи скляні циліндри з дотриманням відстаней наведених у попередньому методі. Далі у встановлені циліндри вносять досліджувані розчини антисептичних препаратів в кількості 0,1 см³.

Метод лунок в товщі агару. Після засіву поживного середовища відповідною тест-культурою за допомогою стерильного свердла виконують лунки на відстані 1,5 – 2,0 см від краю чашки. В лунки вносять водні розчини певного дезінфікуючого засобу різної концентрації, або різні засоби.

При виконанні дослідження методом радіальних штрихів у щільному поживному середовищі вирізають воронку чи доріжку по центру або біля краю чашки Петрі в утворену порожнину вносять певну кількість розчину будь-якої антимікробної речовини, даю їй повністю всмоктатися в агар а далі проводять посіви різних тест-культур штрихом від краю доріжки.

Для оцінки ступеню чутливості мікроорганізмів до антимікробних препаратів при виконанні дослідження будь-яким із наведених методів вимірюють зону затримки росту тестової культури. Відсутність зони затримки росту вказує на те, що досліджувана культура не чутлива до дії даного антимікробного засобу. При діаметрі зони до 15 мм вважають, що мікроорганізми мають малий ступінь чутливості до досліджуваного засобу, діаметр зони від 15 до 25 мм вказує на середній ступінь чутливості. Наявність зони діаметром більше 25 мм свідчить про високий ступінь чутливості мікроорганізмів до даного антимікробного засобу.

 

                

                А                                                              Б   

                          

                В                                                                    Г

Рис. 2. Дослідження чутливості мікроорганізмів до антимікробних препаратів методом: А – паперових дисків, Б – радіальних штрихів, В – лунок в товщі агару, Г – циліндрів.

За допомогою методів лунок в товщі агару та циліндрів можна перевірити ефективність дезінфікуючої дії антимікробного препарату (АМП) використовуючи в якості тест-культур типові для певного виду виробництва контамінанти.

Використовуючи один і той же препарат але у різних концентраціях користуючись методами паперових дисків, лунок в товщі агару та циліндрів можна також визначити мінімальну пригнічуючу концентрацію (МПК) антимікробного засобу. За потреби можна з більшою точністю визначити МПК антимікробних препаратів використовуючи метод Є-тесту.

Є-тест являє собою вузьку смужку полімеру (0,5 x 6,0 см), на яку нанесений градієнт концентрацій антибактеріального препарату (АБП) (від мінімальних до максимальних). Пригнічення росту мікроорганізму довкола смужки Є-тесту відбувається лише в тій зоні, де концентрація АБП, дифундуючого з носія, вище МПК, при цьому утворюється краплевидна зона затримки росту (Рис.3). Значення концентрації АБП в кожній ділянці носія друкарським способом нанесені на зовнішній (зверненій до дослідника) поверхні Є-тесту. Величину МПК враховують в тому місці, де кордон зони затримки росту впритул прилягає до носія.

 

Рис. 3. Визначення МПК антимікробних препаратів методом Є-тесту

 

Завдання на виконання

1. Дослідження антибактеріальної дії антибіотиків.

Чашку Петрі з застиглим МПА перевернути нагору дном і позначити на ньому номери дисків з антибіотиками (за кількістю виданих зразків). У лабораторний зошит занести назви антибіотиків і відповідні їм номери. Потім покласти чашку на стіл кришкою нагору. Дотримуючись правил стерильності, нанести піпеткою на поверхню пластинки агару краплю суспензії бактерій (мікрококи, сарцини чи інші види сапрофітів) ретельно розтерти її по всій поверхні середовища за допомогою стерильного шпателя. Обпаленим пінцетом нанести на поверхню агару диски, просочені антибіотиком (пеніциліном, стрептоміцином, левоміцетином, біоміцином тощо).

Диски розташувати по окружності чашки так, як показано на рис. 2. Чашки помістити у термостат при температурі 37°С.         

Рис. 4. Визначення антимікробної дії антибіотиків методом паперових дисків:

1 – культура стійка до дії антибіотика на даному диску; 2, 3, 4 – культура чутлива до антибіотика; 5 – колонії стійких особин даного штаму; 6 – колонії антибіотикозалежних клітин

2. Визначення впливу фітонцидів цибулі та часнику на плісняві гриби (або бактерії).

У стерильній фарфоровій ступці розтовкти стерильним товкачиком невелику ріпчасту цибулину або зубчик часнику після зняття з них сухих лушпайок.

На поверхню застиглого сусло-агара (СА) чашки Петрі зробити суцільний посів спор досліджуваного гриба. Для цього відібрати стерильною піпеткою 0,2 см³ суспензії спор гриба, нанести її на поверхню агару, розподілити ретельно й рівномірно по всій поверхні СА стерильним шпателем Дригальського. Після цього у чашку в центр засіяної пластинки СА помістити невелику кількість (біля 1 г) подрібнених у ступці цибулі або часнику.

При проведенні визначення впливу фітонцидів цибулі або часнику на бактерії дослід проводиться так само, але береться інше поживне середовище – МПА.

Чашки помістити в термостат з температурою 25 °С.

3. Дослідження ефективності дезінфікуючої дії антимікробних засобів.

Чашку Петрі з застиглим МПА чи СА перевернути нагору дном і позначити на ньому номери дезінфікуючих засобів (за кількістю виданих розчинів). У лабораторний зошит занести назви дезінфікуючих засобів і відповідні їм номери. Потім покласти чашку на стіл кришкою нагору. Дотримуючись правил стерильності, нанести піпеткою на поверхню агару краплю суспензії бактерій, у разі використання МПА чи дріжджів при використанні СА, ретельно розподілити її по всій поверхні середовища за допомогою стерильного шпателя, потім за допомогою пінцета встановити на поверхню пластинки агару циліндри (перед встановленням циліндрів спалюють рештки спирту в якому вони зберігаються), далі піпеткою вносять краплю робочого розчину відповідного деззасобу в кожен з циліндрів.

Циліндри розташовують по окружності чашки Петрі за ти самим принципом, що і паперові диски (рис. 2). Чашки помістити у термостат при температурі 37°С.

Чашки з посівами при виконанні завдань даної лабораторної роботи вміщуючи в термостат не потрібно перевертати.

Послідовність проведення досліду записати.