Глава 5. Применение методов гжх и вэжх в медицине

Газожидкостая хроматография используется во многих областях медицины: в гигиене и экологии для определения содержания вредных примесей в воздухе, воде и пищевых продуктах; в токсикологии и судебной медицине для диагностики отравлений техническими жидкостями (хлорпроизводными углеводородов, алкоголем и его суррогатами) и пестицидами самой различной структуры; в фармакологии и фармации для контроля качества препаратов, исследования метаболизма лекарственных средств.

Применение газовой хроматографии в биохимических целях сравнительно долго не получало должной оценки. Считалось, что биологические объекты недостаточно летучи и малоустойчивы к различным физико-химическим воздействиям, применяемым в газохроматографическом анализе. Успехи в разработке методов расщепления липидов, углеводов и белков до более простых компонентов и превращение их в летучие соединения открыли широкую дорогу для применения метода в биохимическом анализе.

Анализ карбоновых кислот не устаревает. В исследовании липидов, в особенности жирных кислот, газовая хроматография произвела настоящую революцию и до настоящего времени не имеет альтернативы. Первым анализом, выполненным с помощью газовой хроматографии, стало определение Джеймсом и Мартином карбоновых кислот, которые производят в процессе метаболизма микробные клетки.

Исследования состава липидов крови привели к пониманию проблемы атеросклероза - болезни, ведущей к появлению ишемической болезни сердца, нарушениям мозгового кровообращения. Для практической медицины разработаны простые и эффективные средства диагностики нарушений метаболизма липидов. В повседневной практике врачи ежедневно назначают исследования холестерина, триглицеридов, липопротеидов. При разработке этих рутинных методик газовая хроматография использовалась как референтный метод, то есть метод-эталон. Широкое внедрение во врачебную практику исследований метаболизма липидов позволило разработать пути профилактики и лечения атеросклероза.

Возможность определения индивидуального состава жирных кислот тех или иных липидов является чрезвычайно мощным инструментом в познании структуры и функции биологических мембран, процессов внутриклеточного метаболизма. Энергетическое обеспечение клетки осуществляется в так называемом цикле трикарбоновых кислот - цикле Кребса. Газохроматографическое определение спектра карбоновых кислот цикла Кребса внесло большой вклад в понимание интимных процессов внутриклеточного метаболизма при различных патологических состояниях.

Осуществить контроль дисбактериоза традиционными бактериологическими средствами нереально. Выполнение одного детального обследования на дисбактериоз требует свыше года трудозатрат в человеко-часах. Альтернатива этому исследованию - установление спектра карбоновых кислот в кишечном содержимом методом ГЖХ как интегрального показателя микробного состояния кишечника.

Пероксисомные нарушения проявляются в задержке развития, поражении нервной и эндокринной систем, нарушении функции ряда внутренних органов. Практически для всех пероксисомных нарушений характерно накопление в клеточных мембранах и плазме крови так называемых очень длинных насыщенных жирных кислот с длиной цепи 24-28 углеродных атомов. В настоящее время газовая хроматография - самый эффективный метод для определения этих веществ.

Было бы неверно полагать, что газовая хроматография используется только в анализе карбоновых кислот. Разработаны и применяются методы газохроматографического анализа спиртов, альдегидов, аминокислот, углеводов, нуклеотидов, стероидов и других соединений.

В частности, методом газовой хроматографии определяют увеличение содержания ацетона, гептанона-2 и других кетонов при сахарном диабете. Диагностическим показателем цирроза печени служат ароматические кислоты, накопление фенилуксусной кислоты свидетельствует о некоторых заболеваниях нервной системы. Для контроля состояния ожоговых больных определяют производные углеводов - маннитол и лактулозу. Газовая хроматография дает возможность количественно оценить весь клинически значимый спектр стероидов из одной пробы. Подобный анализ незаменим в диагностике некоторых болезней (при нарушениях функции желез внутренней секреции - надпочечников, заболеваниях половой сферы). Были разработаны методы определения так называемых катехоламинов - адреналина, норадреналина - и родственных им соединений, гормонов щитовидной железы, гормонов надпочечников.

Говоря о клеточном метаболизме нельзя не упомянуть о вторичных биорегуляторах. Наиболее интересен один - окись азота (NO). Выяснено, что через посредство NO реализуется механизм расширения кровеносных сосудов. Именно этому обязаны жизнью тысячи пациентов, принимающих нитроглицерин (в биосредах нитроглицерин трансформируется в окись азота). Предполагается, что наличие NO в некоторых нервных окончаниях связано с его участием в реализации механизмов восприятия боли и памяти. Окись азота так или иначе участвует в осуществлении реакций воспалительного каскада, механизмах гибели клеток. Пока единственным прямым методом определения NO в тканях является газовая хроматография.

Технический прогресс сделал возможным получение так называемых метаболических профилей биосред: крови, мочи, слюны, выдыхаемого воздуха. В одном образце анализируются несколько сот компонентов. Метаболические профили так же индивидуальны, как и отпечатки пальцев, но в отличие от папиллярных узоров хроматограмма метаболитов человеческого организма несёт массу медицинской информации: какие лекарства или продукты получал человек в последнее время, каким микроорганизмом вызвано его заболевание и многое другое. Компьютерный анализ метаболических профилей является одним из мощнейших инструментов диагностики врождённых и приобретённых нарушений метаболизма, таких заболеваний, как сахарный диабет, подагра, алкаптонурия, разветвлённо-цепочечная кетонурия - "болезнь кленового сиропа", фенилкетонурия и т.д.

С совершенствованием методов силилирования создавалась новая хроматографическая аппаратура и изыскивались новые жидкие фазы. Все это позволило не только улучшить разделение сложных смесей сахаров, но и расширить область применения ГЖХ вплоть до разделения гептасахаридов. Бробст и Лотт разработали метод, позволяющий проводить анализ образцов, содержащих небольшие количества воды, и, используя его, смогли определить олигосахаридный состав кукурузной патоки вплоть до тетрасахаридов. Позднее в качестве силилирующего агента стал использоваться N-(триметилсилил) имидазол и смесь его с пиридином, ставшая коммерческим реактивом. Показано, что данный реактив обладает хорошими растворяющими свойствами и может использоваться для силилирования влажных образцов сахаров.

Газожидкостная хроматография представляет собой надежный и широко распространенный метод качественного и количественного анализа сахаров. Разделение методом ГЖХ метиловых эфиров сахаров и их производных приобрело особенно большое значение при исследовании структуры олиго- и полисахаридов. Восстанавливающие метилированные сахара нельзя изучать методом ГЖХ в первую очередь потому, что они прочно сорбируются на неподвижной фазе или носителе, и их, как правило, переводят в метилгликозиды. Последние либо непосредственно анализируют на газовом хроматографе, либо, если время удерживания метилгликозидов слишком велико, предварительно ацетилируют или силилируют.

Иногда разрешающая способность колонки недостаточна для разделения аномеров пиранозных и фуранозных форм некоторых метилированных гликозидов или их производных. В таком случае метилированные сахара анализируют в виде ацетатов или триметилсилиловых эфиров альдитов.

Как было установлено, детекторы дают различный отклик на различные метилированные сахара, содержащиеся в одинаковых концентрациях. Результаты определения относительного времени удерживания на одной и той же колонке воспроизводятся с точностью до ± 2%, а на разных колонках с одинаковыми неподвижными фазами - с точностью до ±5%.

Время удерживания многих производных углеводов достаточно велико, что приводит к плохому разделению смесей, обусловливает низкую концентрацию элюируемых компонентов в газе-носителе, и в итоге приводит к увеличению ошибки при определении содержания компонентов в смесях. Поэтому при проведении разделения метилированных сахаров желательно подбирать такие производные и такие условия работы, при которых все компоненты смеси элюировались бы с колонки в течение 70-90 мин с момента их введения. Если детектирование не сопровождается разрушением сахаров, их можно собирать на выходе с хроматографа.

Итак, газожидкостная хроматография - один из самых мощных аналитических методов, разработанных во второй половине нашего столетия. Применение её в медицине носит как прикладной, так и исследовательский характер.

В последние годы широкое распространение в лечении ревматических болезней и острых и хронических мышечно-скелетных болей получили нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) которые относятся к числу наиболее важных «симптоматических» лекарственных средств. При этом производные 1,2 – бензотиазина отличаются от других лекарственных средств уникальным сочетанием противовоспалительных, анальгетических, жаропонижающих и антитромботических свойств.

Для оценки качественного состава производных 1,2 – бензотиазина, а также при разработке методов их количественного определения как в субстанции так и в биоматериале также широко используются методы хроматографирования, а именно ВЭЖХ.

Из всего многообразия методов количественного определения пироксикама в различных лекарственных формах (колориметрия, спектрофотометрия, потенциометрия) для количественного определения в биологическом материале в литературе описан метод ВЭЖХ. Однако, использование ВЭЖХ приводит к расходу большого количества органических растворителей, применяемых в качестве подвижной фазы. Поэтому для анализа пироксикама в биологических пробах была разработана методика количественного его определения с учётом подбора условий хроматографирования изучаемого объекта. Для этого использовали газовый хроматограф фирмы "Varian aerograph" серии 2860 (США) с пламенно-ионизационным детектором.

Субстанцию пироксикама растворяли в хлороформе до образования его растворов с различным содержанием от 0,5 до 100 мкг/мл и в объёме 3 мкл вводили в хроматограф.

Количественную оценку пироксикама в биопробах проводили методом абсолютной калибровки. При хроматографировании об-разцов пироксикама апробировались следующие неподвижные жидкие фазы: Апиезон -L, Апиезон -M, Силикон D.C. - 220, SE - 30, OV - 1, OV - 17, OV - 101 на диатомитовых носителях - хромосорбе G, хромосорбе WHP и хроматоне N-A-W-DMCS.

В результате исследований установлено, что оптимальной неподвижной фазой, при котором бы наблюдалось достаточно чёткое разделение пиков определяемого вещества и растворителя является фаза ОV-17 на хромосорбе WHP (80-100 меш).

Оптимальными условиями хроматографирования являются: использование металлической колонки размером 200х1,8 мм, заполненной неподвижной фазой - 3% ОV-17 на хромосорбе WHP (80-100 меш). Температура колонки 195 ^оС, температура испарителя 260 С, температура детектора 280 ^оС.

Расход газа - азота высокой чистоты 50 мл/мин.; водорода       40 мл/мин.; воздуха 350 мл/мин.

Время удерживания пироксикама - 4 мин 20 сек. Пороговая чувствительность метода определения пироксикама - 0,5 мкг/мл.

Анализировались растворы пироксикама в концентрациях 50,100 и 200 мкг/мл.

Пригодность хроматографической системы оценивали на основании расчёта фактора ассиметричности пироксикама, коэффициента разделения и эффективности колонки.

Фактор асимметричности пика (Т) для пироксикама не более 2%; коэффициент разделения Ki между растворителем и анализируемым веществом - 1,3. Число теоретических тарелок для пироксикама не менее 600.

Разработка методики количественного определения пироксикама в биологическом материале животных включала подбор условий экстракции, осуществляемой на модельных образцах, в качестве которых использовали плазму крови кроликов с различным содержанием лекарственных веществ.

Пироксикам имеет рКa 5,5, а для полноты извлечения его из биологического материала необходимо экстрагировать его из подкисленной плазмы. Поэтому, для полноты извлечения пироксикама из биологических проб использовался 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной.

Для получения модельных образцов растворов пироксикама к  1 мл плазмы крови кроликов с содержанием лекарственного вещества в 100 мкг/мл добавляли 0,5 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной и 5-ти кратный объём хлороформа. Полученную смесь интенсивно встряхивали и после разделения слоёв отбирали органическую фазу и упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 1 мл хлороформа и по 3 мкл вводили в испаритель хроматографической системы.

На основании данных хроматографирования модельных образцов, полученных в процессе экстракции пироксикама хлороформом строили калибровочную кривую модельных растворов пироксикама в том же диапазоне концентраций, что и стандартных растворов.

Процент экстракции пироксикама из модельных образцов плазмы определялся по формуле:

                          К = (tgb /tga) ×100 (18),     

где tga - тангенс угла наклона калибровочной кривой стандартных растворов пироксикама по отношению к оси абсцисс;

  tgb - тангенс угла наклона калибровочной кривой модельных растворов пироксикама после экстракции из модельных образцов различными растворителями.

Методика: к 0,4 мл образца плазмы добавляли 0,2 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты и 2 мл хлороформа. Смесь интенсивно встряхивали 15 мин и центрифугировали при               3000 об/мин в течение 20 мин. После разделения слоёв отбирали органическую фазу и упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 0,2 мл хлороформа и по 3 мкл вводили в испаритель хроматографической системы.  

Методика количественного определения пироксикама использовалась при исследовании фармакокинетики как субстанции, так и его наружных лекарственных форм 1% мази и геля.

Обнаружить примеси и вспомогательные вещества, содержащиеся в лекарственных формах мелоксикама можно методом ВЭЖХ.

Исследования проводили на жидкостном хроматографе LC-20 фирмы «Shimadzu» (Япония), состоящим из насоса для создания градиента высокого давления (LC-20AB), термостата колонок (СТО-20А), инжектора «Реодайн», вакуум-дегазатора и УФ-детектора на диоидной матрице (SPD-M 20А). Обработку данных хроматограмм осуществляли на персональном компьютере с помощью программного обеспечения LC Solution ver. 1.22.

Разделение компонентов проводили на хроматографической колонке с обращенной фазой Symmetry С18 (150 mm ∙ 4,6 mm, 5 mcn) с предколонкой Symmetry С 18 (20 mm∙3,9 mm, 5 mcn). Подвижная фаза, состоящая из канала А представлена 0,5% раствором ортофосфорной кислоты в воде и канала В – представлял собой смесь ацетонитрила с метанолом в соотношении 50/50 (об.)     

Работа насоса осуществлялась в режиме прямолинейного градиента, где содержание элюента В в смеси менялось от 30 до 60% в течение 10 минут. Далее использовали изократический режим в течение 10 минут при соотношении элюентов А/В = 40/60. Время уравновешивания колонки между циклами хроматографирования составляло 7 минут, при начальном соотношении элюентов (А/В = 70/30). Скорость потока составляла 1 мл/мин, температура термостата колонки – 40 ^оС, объём вводимой пробы - 20 мкл.

В хроматографическую колонку последовательно вводили по 20 мкл стандартных растворов метилпарабена, пропилпарабена и мелоксикама, а также растворов испытуемых образцов 1% гелей и 1% мазей мелоксикама. Время анализа составило 20 минут.

Приготовление испытуемого раствора геля (мази) мелоксикама: около 0,5 г геля или мази мелоксикама (точная навеска) отвешивали в мерную колбу на 50 мл, добавляли 5 мл диметилформамида и 5 мл воды для хроматографии, перемешивали до однородного состояния (при необходимости колбу помещали в ультразвуковую ванну на 2-3 минуты). Доводили содержимое колбы до метки водой для хроматографии, перемешивали. Полученный раствор отфильтровывали через мембранный фильтр 0,45 мкм.

Приготовление стандартного раствора метилпарабена, пропилпарабена и мелоксикама: около 0,0188 г стандартного образца метилпарабена и 0,0063 г стандартного образца пропилпарабена (точная навеска) отвешивали в мерную колбу на 100 мл, добавляли 5 мл диметилформамида, перемешивали до растворения. Доводили содержимое колбы до метки водой для хроматографии и перемешивали (раствор А).

Около 0,0100 г стандартного образца мелоксикама (точная навеска) отвешивали в мерную колбу на 100 мл, добавляли 5 мл диметилформамида и 2 мл раствора А, перемешивали до растворения. Доводили содержимое колбы до метки водой для хроматографии и перемешивали (раствор В). Полученный раствор отфильтровывали через мембранный фильтр 0,45 мкм.

 

Содержание мелоксикама в 100 г мази рассчитывали по формуле: X_r = S_x ∙ a_st ∙ 50 ∙ 100 / S_st ∙ а_х ∙ 100 = S_x∙ a_st ∙ 50 / S_st ∙ a_x (19), 

где S_x - средняя площадь пика мелоксикама на хроматограмме испытуемого раствора; 

a_st - навеска стандартного образца мелоксикама, г;

S_st - средняя площадь пика мелоксикама на хроматограмме стандартного раствора;

а_х - навеска мази, г.

 

Содержание метилпарабена и пропилпарабена в 100 г мази мелоксикама рассчитывали по формуле:

Х_г = S_x∙a_st∙2∙50∙100/S_st∙а_х∙25∙100 = S_x∙a_st∙2∙50/S_st∙а_х∙25 (20), 

где Sx - средняя площадь пика метилпарабена (пропилпарабена) на хроматограмме испытуемого раствора;

a_st - навеска стандартного образца метилпарабена (пропилпарабена), г;

S_st - средняя площадь пика метилпарабена (пропилпарабена) на хроматограмме стандартного раствора;

а_х - навеска мази, г.

 

Данная методика позволяет определить такие показатели, как подлинность, количественное содержание компонентов и содержание посторонних примесей. Достоверность результатов доказывают установлением пригодности хроматографической системы, отражённых в таблице 4.

Таблица 4