Глава 4. Высокоэффективная жидкостная хроматография

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медленного продвижения подвижной фазы занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).

Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и проведения качественного и количественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой. В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют два варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемаяобращённо-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОфВЖХ). При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбентов и неводных подвижных фаз.

Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЭЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЭЖХ проводят именно этим методом.

Аппаратура для ВЭЖХ

Комплект современного оборудования для ВЭЖХ, как правило, состоит из двух насосов 3, 4 (рис. 10), управляемых микропроцессором 5, и по дающих элюент по определённой программе. Насосы создают давление до 40 МПа. Проба вводится через специальное устройство (инжектор) 7 непосредственно в поток элюента. После прохождения через хроматографическую колонку 8 вещества детектируются высокочувствительным проточным детектором 9, сигнал которого регистрируется и обрабатывается микро-ЭВМ 11. При необходимости, в момент выхода пика автоматически отбираются фракции.

Рис. 10. Схема современного жидкостного хроматографа:  1,2 - сосуды с элюентами; 3, 4 - насосы; 5 контроллер; 6 – смесительная камера; 7 - инжектор; 8 - колонка; 9 - детектор;10 – регистратор; 11 - блок автоматической обработки результатованализа;   12 - коллектор фракций; 13- термостат.

 

Колонки. Длина колонки играет важную роль при выборе условий разделения, так как она влияет как на селективность и эффективность колонки, так и на продолжительность анализа. При увеличении длины колонки вдвое во столько же раз увеличивается продолжительность анализа, в то время как критерий разделения увеличивается лишь пропорционально корню квадратному из длины.

Длина колонок, применяемая в ВЭЖХ, обычно составляет 15-150 см и не превышает 10 м. За стандартную принята длина в 1 м. Увеличение диаметра колонки приводит к дополнительному размыванию, но увеличивает производительность колонки. Поэтому выбор, как диаметра колонки, так и её длины должен быть компромиссным. В ВЭЖХ внутренний диаметр обычно равен 1-6 мм и редко превышает 12 мм. Уменьшение диаметра лимитируется трудностями заполнения колонки, а также чувствительностью детектора, увеличение - уменьшением скорости движения подвижной фазы.

Короткие колонки обычно делаются прямыми или же U-образными. При длине колонок свыше 3-4 м рекомендуется придавать им спиральную форму. Материалом для колонок может служить толстостенное стекло или нержавеющая сталь. Стеклянные колонки удобны для визуального контроля заполнения их сорбентом.

Для ВЭЖХ особое значение приобретают плотность и равномерность заполнения колонки сорбентом. Поэтому зерна адсорбента должны иметь сферическую форму и одинаковый диаметр  (10-20 мкм). Такие частицы упаковываются более плотно и равномерно по всему объему колонки. Плотное заполнение приводит к лучшему поперечному смешению подвижной фазы и образца, а также создает лучшие условия для сохранения по­стоянства скорости потока жидкости.

От плотности заполнения и размеров частиц зависит объём вводимой пробы. Он возрастает с уменьшением размеров частиц и увеличением плотности упаковки и обычно составляет 0,05-50 мкг.

Скорость потока подвижной фазы влияет на разделительную способность колонки, а также на продолжительность анализа. В общем случае разделительную способность можно увеличить уменьшением скорости потока. Линейная скорость потока обычно составляет от 1 до 10 см/с.

Важным рабочим параметром в ВЭЖХ является градиент давления в колонке. Он зависит от вязкости подвижной фазы, длины колонки, линейной скорости потока жидкости, диаметра частиц адсорбента, возрастая обратно пропорционально квадрату их диаметра. В жидкостной хроматографии температура оказывает значительно меньшее действие, чем в газовой. В большинстве случаев анализ в ВЭЖХ проводят при комнатной температуре. Повышение температуры применяют для увеличения скорости анализа, улучшения растворимости анализируемых веществ, а также в отдельных случаях для улучшения разделения.

Ввод пробы. Существует два способа ввода: посредством шприца и при помощи крана. Главным достоинством ввода пробы посредством шприца является возможность подачи пробы непосредственно на насадку, что существенно уменьшает первоначальное размывание зоны вещества. Шприц позволяет легко регулировать объём вводимой пробы. Наконец, этот способ прост в конструктивном отношении. Однако при достаточно высоких давлениях способ становится непригодным, так как проба через неплотности в поршне может проникать в обратном направлении.

Система для ввода пробы состоит из двух кранов и ёмкостей, присоединенных к верхней части хроматографической колонки. Сначала поток элюента под давлением поступает через 1-й кран, ёмкость 1 и 2-й кран в колонку. В это время по трубке ёмкость 2 заполняется пробой вещества. Затем 1 и краны переключаются в другое положение. При этом поток элюента переносит пробу из ёмкости 2 в колонку, а ёмкость заполняется следующей пробой.

Этот способ позволяет автоматизировать процесс ввода пробы и работать при достаточно высоких давлениях. Однако краны должны быть тщательно пришлифованы, чтобы исключить возможную утечку.

Недостатком способа является размывание пробы в процессе ввода, однако его можно уменьшить, сокращая до минимума объём соединительных трубок. Кроме того, для изменения объема пробы требуется иметь набор резервуаров различной ёмкости.

Подача растворителя. В современных хроматографах применяются три типа устройств: поршневые насосы, насосы в виде большого шприца и беспоршневая подача при помощи давления газом.

Для подачи жидкости под давлением газа она помещается в тонкостенный резервуар из полимерного материала. Резервуар, в свою очередь, помещён в металлический сосуд, в который при помощи вентиля подаётся сжатый газ. Этот газ сжимает резервуар с жидкостью, благодаря чему она выдавливается через другой вентиль в колонку. Скорость подачи жидкости определяется давлением, создаваемым в металлическом резервуаре. Благодаря отсутствию пульсации и трущихся частей этот способ наиболее прост и надежен. К недостаткам его относится необходимость периодического заполнения резервуара жидкостью.

Дегазация подвижной жидкости до её подачи в насос обязательна, так как выделение пузырьков растворенного в ней газа в колонке, особенно в детекторе, весьма нежелательно. Оно может быть вызвано понижением давления в системе или повышением температуры. Пузырьки газа в колонке снижают её эффективность, а попадание их в детектор вызывает беспорядочные колебания нулевой линии. Дегазация жидкости производится двумя способами: нагреванием или вакуумированием.

Колонки заполняют сорбентом (неподвижная фаза). В качестве неподвижной фазы используются силикагель, оксид алюминия или модифицированные сорбенты. Модифицируют обычно силикагель, внедряя химическим путём в его поверхность различные функциональные группы.

Адсорбенты. В современной ВЭЖХ применяют адсорбенты, обеспечивающие не только высокоэффективные селективность и эффективность, но и достаточную скорость процесса хроматографирования, соизмеримую со скоростью в газовой хроматографии. Для этого адсорбент должен обладать не только соответствующими адсорбционными свойствами поверхности, но и определенной её структурой: диаметром, глубиной и числом пор.

 Эту задачу можно решать двумя путями: применением поверхностно-пористых адсорбентов и применением обычных объёмно-пористых адсорбентов, но обладающих относительно небольшой удельной поверхностью (порядка 50 м²/г) и имеющих зёрна малого порядка (10-100 мкм).

В поверхностно-пористых адсорбентах (ППА) нет глубоких пор, поэтому время пребывания вещества в подвижной фазе, находящейся в порах, снижается, и скорость массообмена увеличивается. ППА позволяют вести процесс в условиях, близких к равновесным, не снижая скорости вымывания.

Кроме отличных структурных свойств ППА обладают большой механической прочностью, т.к. их ядром обычно являются стеклянные шарики. ППА прекрасно регенерируются и обладают сравнительно небольшим сопротивлением потоку. Благодаря правильной сферической форме и постоянному диаметру зерен, в колонках, заполненных ППА, снижается размывающее действие вихревой диффузии, а заполнение колонок не требует никаких специальных мер, обеспечивающих равномерность укладки зёрен адсорбента.

Применение мелкозернистых адсорбентов создает, однако, дополнительные трудности в связи с тем, что возникает значительное сопротивление потоку, требующее повышенных перепадов давления порядка 40-80-105 Па при высоте колонки 15-20 см. Современные жидкостные хроматографы изготавливаются с учётом этих требований. В качестве объёмно-пористых мелкозернистых адсорбентов в колоночной ВЭЖХ применяют силикагели, алюмогели и некоторые другие вещества, например, силикат натрия, гидроксид кальция.

При выборе адсорбента обычно следует обратить внимание на следующие три проблемы, возникающие в ВЭЖХ:

1. Изменение или потеря определяемых веществ в колонке вследствие химического или каталитического взаимодействия адсорбента с веществом.

2. Плохая воспроизводимость работы адсорбента.

3. Нестабильность работы колонки.

Применяемые адсорбенты обычно обладают кислыми или основными свойствами. Поэтому хроматографируемые вещества, чувствительные к изменению pH среды, могут претерпевать изменения.

Для лучшей воспроизводимости результатов хроматографирования следует пользоваться адсорбентами промышленного производства и проводить хроматографирование в строго определённых стандартных условиях.

Подвижная фаза. В колоночном варианте ВЭЖХ могут применяться все известные методы проведения хроматографического процесса: фронтальный, проявительный, вытеснительный и комбинированный.

В любом из них подвижной фазой служит какой-либо жидкий растворитель или смесь растворителей. В практике колоночной ВЭЖХ нашли применение лишь два метода: проявительный и комбинированный. В любом из методов к подвижной фазе растворителю предъявляют определенные требования. Прежде всего, любой растворитель должен хорошо растворять все компоненты анализируемой смеси, не взаимодействуя с хроматографируемыми веществами, адсорбентом и кислородом воздуха.

В проявительном методе растворитель, кроме того, не должен адсорбироваться применяемым адсорбентом. В комбинированном методе добавляемый к основному растворителю вытеснитель должен обладать свойством адсорбироваться сильнее тех компонентов смеси, которые подлежат вытеснению со слоя.

В препаративном варианте ВЭЖХ растворитель должен легко отделяться от выделяемого вещества. Он должен быть либо достаточно летуч, чтобы его можно было удалить простой перегонкой, либо хорошо растворим в воде, если основное вещество, наоборот, в воде нерастворимо.

Во всех случаях растворитель должен быть маловязким, не содержащим примесей и достаточно доступным. Наконец, свойства растворителя должны соответствовать требованиям, обеспечивающим нормальную работу применяемого детектора. Желательно также, чтобы растворитель позволял легко регенерировать адсорбент, т.е. чтобы при окончании процесса он полностью удалял с поверхности адсорбента все адсорбированные вещества и мог быть легко удален сам.

В жидкостной хроматографии в функцию подвижной фазы входит еще и влияние на селективность колонки. Это свойство подвижной жидкой фазы имеет первостепенное значение для ВЭЖХ, так как оно позволяет достигать оптимальных условий разделения не только выбором соответствующего селективно действующего адсорбента, что не всегда просто, но и подбором системы растворителей, действующих селективно. В качестве растворителя применяют вещество, слабо или совсем не адсорбирующееся на выбранном адсорбенте, и в него добавляют вещества, адсорбирующиеся сильнее всех или некоторых компонентов анализируемой смеси (вытеснитель). При этом получается сочетание проявительного метода с вытеснительным. Слабо адсорбирующиеся компоненты смеси вымываются из колонки первыми вследствие вымывающего действия растворителя (элюента). Здесь разделение смеси соседних компонентов обеспечивается селективным действием адсорбентов. Затем колонку начинают промывать раствором вытеснителя в этом же растворителе. Происходит вытеснительная десорбция и элюирование компонентов в порядке возрастания адсорбционной активности.

При введении в подвижную фазу веществ, обладающих различной адсорбционной активностью, вымывание компонентов анализируемой смеси происходит в зависимости от активности как вымывающих, так и вымываемых веществ. В идеальном случае можно получить градиентную хроматографию, т.е. метод, при котором состав подаваемой в колонку подвижной фазы непрерывно изменяется, причем так, что её вытесняющая способность возрастает. Здесь подвижная фаза, выполняя присущие ей обычные функции, оказывает влияние еще и на селективность колонки. 

Таким образом, в ВЭЖХ экспериментатор может, подбирая адсорбент, состав подвижной фазы, добиваться высокой степени разделения смеси веществ, весьма близких по свойствам.

Селективность. В основе жидкостной хроматографии лежит различие адсорбируемости компонентов раствора на твёрдой неподвижной фазе - адсорбенте, обладающем высокоразвитой поверхностью. Поэтому теория равновесной жидкостной хроматографии базируется на теории адсорбции из бинарных или многокомпонентных растворов.

Эффективность. Рассмотренные свойства системы адсорбат–адсорбент определяют селективность хроматографической колонки. Однако для полноты разделения смеси кроме селективности необходима еще и высокая эффективность. Она зависит от процессов диффузии и массопередачи как в подвижной, так и неподвижной фазах и определяется величиной Н (высота, эквивалентная одной теоретической тарелке - ВЭТТ).

В связи с тем, что современная жидкостная хроматография является высокоэффективной хроматографией, процессы которой осуществляются при значительных линейных скоростях, вопрос об эффективности колонки следует рассмотреть с позиций зависимо-сти Н от 1. Чем меньше длина диффузионного пробега, тем быстрее массопередача, тем меньше значение Н. Поэтому в ВЭЖХ применяются специально приготовляемые поверхностно-пористые адсорбенты.

Для адсорбции и десорбции растворённого вещества необходимо определённое среднее время. Таким временем можно считать время пребывания в неподвижной фазе. Оно связано с глубиной проникновения в неподвижную фазу, т.е. с глубиной пор сорбента и коэффициентом диффузии. Именно большое значение глубины пор сорбента, характерное для классической жидкостной хроматографии, является одной из причин её низкой эффективности. В современной ВЭЖХ применяются поверхностно-пористые адсорбенты. Их принципиальное отличие от обычных адсорбентов состоит в том, что на твёрдое, не обладающее пористостью сферическое зерно носителя нанесён тонкий слой адсорбента с высокой пористостью. Для увеличения плотности заполнения колонки зернам носителя придают сферическую форму и одинаковый для всех зёрен диаметр (20-40 мкм). Толщина слоя пористого вещества составляет примерно 1 мкм. Такого рода адсорбенты не обладают глубокими порами, поэтому длина диффузионного пробега в адсорбенте существенно снижается, скорость массопереноса возрастает, что приводит к уменьшению значения Н и значительному увеличению эффективности колонки. Глубину пор адсорбционного слоя можно снизить, если уменьшить диаметр зёрен носителя, например, до 1-10 мкм.

Степень разделения двух веществ в ВЭЖХ определяется, как и в газовой, критерием разделения К, зависящим как от селективности, так и от эффективности колонки. Однако при проведении хроматографического анализа важно не только полное разделение, но и возможно меньшая продолжительность анализа.

В ВЭЖХ вследствие незначительных коэффициентов диффузии в жидкостях влияние на эффективность колонки могут оказывать так называемые внеколоночные эффекты, т.е. размывание, возникающее в соединениях колонки с детектором, а также в камере детектора. Поэтому очень важно, чтобы объёмы подводящих трубок, камеры детектора были минимальными.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хроматограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца последовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из колонки отдельных компонентов смеси.

В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др. В случае разделения смеси на внешней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хроматограмме используют для целей идентификации вещества, высоту или площадь пика - для целей количественного определения.

В жидкостной хроматографии применяют три типа детекторов:

1 - реагирующие на изменение определенного свойства раствора - рефрактометрические детекторы и детекторы по проводимости и диэлектрической проницаемости;

2 - реагирующие на свойства растворённых веществ; такие детекторы чувствительны к тем свойствам растворённого вещества, какими не обладает растворитель, - детекторы по поглощению видимого, ультрафиолетового или инфракрасного излучения, полярографические или микроадсорбционные детекторы, а также детекторы по радиоактивности;

3 - детекторы, работающие после удаления растворителя. В этом случае вещество детектируется одним из применяющихся в газовой хроматографии детекторов. К ним относится транспортный плазменно-ионизационный детектор.

Качественный анализ

Качественные определения проводят по величинам удерживания, а количественные - по высотам или площадям пиков на хроматограммах. Характерным для жидкостной хроматографии является анализ вытекающего из колонки раствора химическими, физико-химическими или физическими методами. При этом вытекающий из колонки раствор собирают в виде отдельных фракций. Обычно для сбора фракций применяют специальные коллекторы, работающие автоматически. Собранные в коллекторные пробирки фракции подвергаются анализу. Анализируют или непосредственно собранные растворы, или же растворитель предварительно удаляют нагреванием раствора на водяной бане.

Качественная идентификация компонентов анализируемой смеси производится одним из следующих методов: химическим микроанализом по характерным окраскам, появляющимся в результате взаимодействия анализируемого вещества с добавляемым реагентом, по спектрам поглощения в ультрафиолетовой или инфракрасной областях; по спектрам флуоресценции; по масс-спектрам или же по спектрам ядерного магнитного резонанса.

Важнейшие характеристики хроматограммы - время удерживания и связанный с ней удерживаемый объём - отражают природу веществ, их способность к сорбции на материале неподвижной фазы и, следовательно, при постоянстве условий хроматографирования являются средством идентификации вещества.

Для идентификации вещества по хроматограмме обычно используют стандартные образцы или чистые вещества. Сравнивают время удерживания неизвестного компонента t_Rx с временем удерживания t _RCT известных веществ.

Но более надежна идентификация по измерению относительного времени удерживания. При этом в колонку сначала вводят известное вещество (внутренний стандарт) и измеряют время его удерживания t_{R (BC)}, затем хроматографически разделяют (хроматографируют) исследуемую смесь, в которую предварительно добавляют внутренний стандарт. Относительное время удерживания определяют по формуле.

Количественный анализ

Количественные измерения проводят, определяя концентрации вещества в каждой пробирке и суммируя полученные данные для всего объёма вытекающего из колонки раствора, содержащего определяемое вещество. Если известны начало и конец выхода раствора, содержащего определяемое вещество, то весь этот раствор сливают вместе и в нём определяют концентрацию анализируемого вещества. Таким образом, погрешность количественных измерений определяется погрешностями аналитического метода и измерения объёмов собранных порций раствора. В этом случае точность количественных определений по хроматограммам может оказаться выше точности непосредственного анализа хроматографических фракций. Электрическими или электронными интеграторами снабжены современные хроматографы. Для определения содержания веществ в пробе используют в основном три метода: метод абсолютной градуировки, метод внутренней нормализации и метод внутреннего стандарта.

Метод абсолютной градуировки основан на предварительном определении зависимости между количеством введённого вещества и площадью или высотой пика на хроматограмме. В хроматограмму вводят известное количество градуировочной смеси и определяют площади или высота полученных пиков. Строят график зависимости площади или высоты пика от количества введённого вещества. Анализируют исследуемый образец, измеряют площадь или высоту пика определяемого компонента и на основании градуировочного графика рассчитывают его количество.

Метод внутренней нормализации основан на приведении к 100% суммы площадей всех пиков на хроматограмме. Расчёт массовой доли в % одного компонента проводят по формуле:

K_AS_A

w_(a)% = ________________ (16),

K_AS_a+K_bS_b+...K₂S_i

где К - поправочные коэффициенты;

S_a, S_b, S_i - площади пиков компонентов смеси.

Этот метод даёт информацию только об относительном содержании компонента в смеси, но не позволяет определить его абсолютную величину.

Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества, введенного в пробу в известном количестве. В исследуемую пробу вводят известное количество такого стандартного вещества, пик которого достаточно хорошо отделяется от пиков компонентов исследуемой смеси.

Проводят анализ пробы с внутренним стандартом и рассчитывают количество определяемого вещества по формуле:

                                          k_(a) h_(a)

g_(а) = ___________ g_(BC) (17), 

                                       K_(BC) h_(BC)

где g_(A) - количество определяемого компонента А;

  h_(A) - высота пика компонента A;

g_(BC) - количество внутреннего стандарта;

h_(BC) - высота пика внутреннего стандарта;

к_(A) и k_(BC) - поправочные коэффициенты.

В последних двух методах требуется введение поправочных коэффициентов, характеризующих чувствительность используемых детекторов к анализируемым веществам. Для разных типов детекторов и разных веществ коэффициент чувствительности определяется экспериментально.

В жидкостной адсорбционной хроматографии используется также анализ фракций растворов, собранных в момент выхода вещества из колонки. Анализ может быть проведён различными физико-химическими методами.

С помощью ВЭЖХ можно определять красители, органические кислоты, аминокислоты, сахара, примеси в лекарственных веществах.