Основные принципы и этапы приготовление гистологических препаратов. Методы выявления нервных элементов и эластической ткани. Гистохимия. Особенности приготовления препаратов эмбрионов.

Цитодиагностика – изучение мазков крови, костного мозга, слюны, спинно-мозговой жидкости, мочи, влагалищных мазков и т.д.

Биопсия – прижизненное взятие ткани для гистологического исследования с целью диагностики заболеваний.

Изготовление гистологических препаратов складывается из следующих основных этапов:

1. Взятие и фиксация биологических объектов;

2. Промывка, обезвоживание и заливка биологических объектов;

3. Приготовление срезов;

4. Окрашивание и заключение срезов.

       1 - взятие и фиксация биологических объектов.

Главное требование: максимальное сокращение сроков взятия материала, минимальное травмирование тканей и создание оптимальных условий для фиксации.

Фиксация предупреждает развитие посмертных изменений в тканях, прекращая в них биохимические процессы. В основе действия любого фиксатора лежат сложные физикохимические процессы, в первую очередь, коагуляция (свертывание) белков.

В гистологической практике применяют различные фиксаторы: простые, содержащие один компонент (формалин, спирт, ацетон) и сложные, содержащие два и более компонентов (жидкость Карнуа: абсолютный спирт, хлороформ, ледяная уксусная кислота; жидкость Ценкера: двухромовокислый калий, сернокислый натрий, сулема, формалин, дистиллированная вода).

Промывание, обезвоживание и заливка биологических объектов.

 После фиксации кусочки промывают под проточной водой в течение 12-24 часов для освобождения от излишков фиксатора. После промывания объекты необходимо обезводить и уплотнить в спиртах возрастающей крепости, для чего последовательно используют 50, 60, 70, 90, 96 и 100о спирт. Далее кусочки просветляют, для чего их помещают сначала в смесь абсолютного спирта (100о) и Оксилола (1:1), затем в две-три порции чистого О-ксилола. После просветления материал готов к пропитыванию в парафинах.

Приготовление гистологических срезов.

Для приготовления срезов используют специальные приборы – микротомы. Их три типа: санный, ротационный и замораживающий. Санный микротом позволяет получать ступенчатые срезы, ротационный – серийные, замораживающий дает возможность получать срезы фиксированного и нефиксированного биологического материала без предварительной заливки в парафин. Все микротомы снабжены механизмом подачи микрообъекта и специальным микротомным ножом.

 4 - окрашивание и заключение срезов.

Окрашивание срезов применяется для того, чтобы отчетливо видеть под микроскопом строение органа, и основано на неодинаковом химическом составе тканевых структур. Для окрашивания применяется большое количество красителей. Все их можно разделить по происхождению: растительные (гематоксилин), животные (кармин), синтетические (эозин и др.); а также по химическим свойствам: кислые, основные, нейтральные.

 

Существуют специфические красители. Например, эластические волокна окрашиваются орсеином в красно-коричневый цвет, резорцин-фуксином – в темно-синий, альдегид-фуксином – в темнопурпурный. Жиры и жирорастворимые вещества в клетках окрашиваются суданомIII в оранжевый цвет, осмий же окрашивает жиры в черный цвет. Для выявления элементов нервной системы применяется метод импрегнации азотнокислым серебром.

Гистохимия - раздел гистологии, посвященный анализу химической природы компонентов тканей с помощью микроскопических методов.

 

Методы цитологических и гистологических исследований. Виды микроскопии: световая (в светлом поле, ультрафиолетовая, метод темного поля, люминесцентная, фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная), электронная (трансмиссионная, сканирующая, высоковольтная). Метод замораживания – скалывания. Культура тканей, микрургия. Клеточная инженерия, понятие о гетерокарионе, гибридизация.

Цитодиагностика – изучение мазков крови, костного мозга, слюны, спинно-мозговой жидкости, мочи, влагалищных мазков и т.д.

Биопсия – прижизненное взятие ткани для гистологического исследования с целью диагностики заболеваний.

Культура тканей - выращивание тканей в искусственной среде.

Микрургия – микроманипуляции при исследовании микроскопических объектов Клеточная инженерия - создание клеток нового типа на основе их гибридизации, реконструкции и культивирования.

Гетерокарион - клетка, содержащая два или более ядер, имеющих разные генотипы. Гибридизация- — процесс образования или получения гибридов, в основе которого лежит объединение генетического материала разных клеток в одной клетке.

Световая микроскопия - Основной метод исследования тканей и клеток, использующий спектр видимого света. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра.

Широкопольная микроскопия - Поле наблюдения равномерно и широко освещается с помощью конденсора. Изображение является результатом различного поглощения света участками окрашенного гистологического среза.

Темнопольная микроскопия - Для изучения живых клеток и бактерий Прямые лучи не проходят в объектив, а только периферические лучи, которые формируются диафрагмой или специальным темнопольным конденсором и падают на препарат под косыми углами Освещение сбоку на фоне темного поля Светятся мельчайшие частицы (0,2 мкм)       

Ультрафиолетовая микроскопия - Используется ультрафиолетовый спектр длиной волны 250 нм Разрешающая способность порядка 0,1 мкм Используется для цитофотометрии и флюоресцентной микроскопии

Флуоресцентная (люминесцентная) микроскопия - Объект облучают ультрафиолетовыми лучами, которые возбуждают флуоресцентные вещества к излучению света видимой частью спектра. Позволяет судить о химическом составе вещества.

Различают:

· Первичную флуоресценцию – ею обладают некоторые пигменты (хлорофиллы), витамины (А, В2)

· Вторичную флуоресценцию – после обработки специальными красителями флуорохромами: акридиновый оранжевый, флуоресцин, аурамин, родамин и др.)

Фазово-контрастная микроскопия - При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные – фаза световой волны, что и используют для получения высоко контрастного изображения.

Интерференционная микроскопия - Для изучения живых клеток, их массы, концентрации веществ в них.

Принцип работы: световой пучок расщепляется комплексом линз, один пучок идет через гистопрепарат, другой мимо. Затем оба пучка собираются, и возникает интерференционное изображение.

Поляризационная микроскопия - Поляризационная микроскопия позволяет изучать ультраструктурную организацию тканевых компонентов на основе анализа анизотропии и/или двойного лучепреломления.

 

В электронных микроскопах используют пучок электронов

Трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия: Подготовка объекта фиксация в глутаральдегиде и OSO4 дегидратация в спиртах возрастающей крепости; заливка в эпоксидные смолы (эпон, аралдит) изготовление ультратонких срезов толщиной 0,05 – 0,1мкм на ультратоме с помощью алмазных или стеклянных ножей;размещение на медной сетке и контрастирование солями свинца

Сканирующая электронная микроскопия: Дает трехмерное объемное изображение Объект фиксируют, высушивают в вакууме, напыляют тонким слоем золота Тонкий пучок электронов пробегает по поверхности золотой реплики, отражается, информация передается на электронно-лучевую трубку.

Высоковольтная электронная микроскопия: Ускоряющее напряжение 1- 3 млн В Позволяет исследовать срезы толщиной 1 -10 мкм, более высокая разрешающая способность.

Метод замораживания – скалывания: Клетки замораживают при температуре жидкого азота (196О С) в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнажённую внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем ЭМ

Метод замораживания – травления: Сходен с предыдущим методом. Но после скалывания перед напылением платиной объект помещают в вакуум при T= -100оС. Удаляются кристаллы льда и обнажаются новые детали, невидимые при простом замораживании – скалывании.

 

История развития гистологии. Зарубежные гистологические школы 19 века (Пуркине, И. Мюллер, С. Рамон-и-Кахал и др.) Развитие гистологии в России – Петербургская, Московская, Киевская, Казанская, Томская гистологические школы. Вклад в развитие нейрогистологии профессоров Ф. С. Догеля и А. Е. Смирнова.

В истории учения о тканях и микроскопическом строении органов выделяют три периода:

· l -й - домикроскопический (продолжительностью около 2000 лет),

· 2-й микроскопический (около 300 лет),

· 3-й - современный, сочетающий достижения в области электронной микроскопии, иммуноцитохимии, цитофотометрии и др. (с середины XX столетия).

Первый двухлинзовый несовершенный микроскоп сконструировали братья Ганс и Захарий Янсоны в 1590 г. Р. Гук (1665) впервые описал строение коры пробкового дуба и стебля растений и ввел в науку термин клетка для обозначения ячеек, мешочков, из которых они состояли. М. Мальпиги и Н. Грю (1671-1682) описали микроструктуру некоторых органов растений. В период с 1676 по 1719 г. А. Левенгук открыл красные кровяные тельца, некоторых простейших животных,сперматозоиды. Иоганнес Мюллер