Фоточувствительные пигменты и фототрансдукция

Кванты света, падающего на фоторецептор, проходят через стопку из примерно 2000 мембранных дисков в его наружном сегменте. Наружные сегменты всех фоторецепторов ориентированы таким образом, что их продольная ось направлена на отверстие зрачка, т.е. строго параллельно направлению распространения световых лучей, достигающих сетчатки. Кроме того, стопка дисков действует как световод, направляющий кванты света строго вдоль его продольной оси и минимизирующий потери на рассеяние. В мембране дисков содержится очень много зрительного пигмента – например, в палочках, где фоточувствительным пигментом является родопсин, он составляет 80% белка, связанного с мембранами дисков. Расчеты показывают, что расстояние между соседними молекулами родопсина составляют около 6 нм. Такая организация обеспечивает высокую вероятность того, что квант света встретится с молекулой фоточувствительного пигмента и активирует его.

 

Фоточувствительные пигменты. Рассмотрим вначале зрительный пигмент палочек – родопсин (rhodopsin, от греч. rhódo роза и ops глаз, ópsis зрение). Этот пигмент называют иногда "зрительным пурпуром", поскольку приготовленный в темноте раствор родопсина имеет красноватый цвет; такой оттенок он приобретает из-за того, родопсин поглощает свет в сине-зеленой части спектра (максимум поглощения около 500 нм). Родопсин представляет собой комплекс хромофора – низкомолекулярной молекулы небелковой природы – связанного с белком опсином.

Собственно фоточувствительная часть зрительного пигмента, или хромофор, является небелковой органической молекулой – ретиналем (рис. [1415] ____). Ретиналь представляет собой альдегид витамина A (ретинола), который, в свою очередь, образуется в организме из каратиноидов – желтых, оранжевых и красных жирорастворимых пигментов, придающих, в частности, характерный цвет моркови. В отличие от большинства беспозвоночных, позвоночные не способны синтезировать витамин A самостоятельно и нуждаются в поступлении в организм с пищей самого витамина A или его предшественников – каратиноидов.

Ретиналь связан с опсином по типу шиффова основания в результате взаимодействия альдегидной группы ретиналя с аминогруппой лизинового остатка опсина. Эта связь непрочная и легко рвется. Семь мембранных доменов опсина образуют структуру, напоминающую бочку, а ретиналь располагается внутри нее – во внутренней полости (или, скорее, "кармане"), образованной семью доменами опсина (рис. [1416] ____).

Опсины относятся к очень большому и важному семейству семидоменных белков, в которое входят также обонятельные рецепторные белки, некоторые вкусовые рецепторные белки и многие синаптические рецепторы. Таким образом, опсины имеют тесное родство с хеморецепторными белками, а саму фоторецепцию можно рассматривать как модифицированную хеморецепцию. Чтобы реализовать такую идею, нужно лишь иметь небольшую молекулу, химически изменяющуюся под действием света – а дальше достаточно уже отлаженной системы хеморецепции. Удачным кандидатом на роль такой молекулы, закрепившимся в эволюции, оказался ретиналь. Следует сказать, что данная система фоторецепции невероятно древняя и встречается не только в сетчатке глаза. Например, такую же молекулярную структуру имеет меланопсин – зрительный пигмент меланофоров, позволяющих некоторым животным быстро изменять окраску своего тела в зависимости от освещения, и даже бактериородопсин – светочувствительный пигмент некоторых бактерий. Дальнейшая передача сигнала от белков данной группы осуществляется в клетке благодаря системе G-белков.

 

Трансдукция в фоторецепторах. Ретиналь, обладая системой сопряженных двойных связей между атомами углерода, способен захватывать кванты света. Для функционирования зрительной системы важно то, что ретиналь существует в двух изомерных формах: 11- цис -ретиналь и транс -ретиналь (рис.). Исходно с опсином связана цис -форма этой молекулы. Под воздействием захваченного кванта света происходит стереоизомеризация ретиналя: цис-форма с вероятностью немногим выше 50% превращается в более низкоэнергетическую транс-форму. Процесс стереоизомеризации проходит последовательно через несколько промежуточных стадий. В фоторецепции важен переход к промежуточному продукту, называемому метародопсином-2, который занимает всего около 1 мс. Именно на этой стадии изменившаяся геометрия молекулы хромофора ведет к изменению конформации молекулы опсина и, соответственно, к активации G-белковой системы.

После стереоизомеризации молекула транс -ретиналя уже не может оставаться в предназначенном для нее "кармане" опсина. В результате шиффова связь рвется, а транс -ретиналь покидает молекулу опсина. Вопреки распространенному упрощенному представлению, отрыв ретиналя от опсина происходит значительно позже по отношению к воздействию света (в течение нескольких минут) и уже не имеет никакого отношения к фототрансдукции как таковой. В случае палочек реизомеризация ретиналя обратно в 11- цис -ретиналь происходит в пигментном эпителии. Для колбочек реизомеризация ретиналя происходит в самой сетчатке без участия пигментного эпителия.

У беспозвоночных молекула ретиналя остается ковалентно связанной с опсином, а под действием света в зависимости от длины волны происходит как переход родопсина в метараодопсин, так и обратный процесс.

Рассмотрим дальнейшую последовательность событий, происходящих вслед за стереоизомеризацией ретиналя и изменением конформации опсина, т.е. его активацией (рис. [1417] ____). Будучи в активном состоянии, молекула опсина способна реагировать с G-белковой системой. G-белок наружных сегментов фоторецепторов имеет много специфических особенностей и называется трансдуцином, или T-белком. Как и в случае с другими G-белками, активированная рецепторная молекула реагирует с α-субъединицей трансдуцина. При этом α-субъединица обменивает связанный с ней ГДФ на ГТФ, отсоединяется от опсина и в таком активированном состоянии контактирует со своей мишенью. В отличие от обычной G-белковой системы, мишенью α-субъединицы здесь оказывается не фермент, синтезирующий вторичные посредники – циклонуклеотиды, а фермент противоположного действия, их разрушающий, а именно цГМФ-фосфодиэстераза. Под воздействием α-субъединицы трансдуцина этот фермент активируется и начинает гидролизовать цГМФ, содержащейся в цитоплазме, в 5'-ГМФ. Таким образом, мы пришли к тому, что под воздействием света в наружном сегменте фоторецептора происходит снижение концентрации цГМФ.

Активации самого опсина противодействуют два белка – родопсинкиназа и арестин, которые инактивируют его. Родопсинкиназа фосфорилирует родопсин и этим препятствует его взаимодействию с трансдуцином. Для полной десенситизации родопсина требуется, чтобы помимо его фосфорилирования к нему присоединился арестин.

Теперь нам необходимо разобраться с тем, какова же роль цГМФ в наружных сегментах фоторецепторов и к чему ведет снижение его концентрации. Под воздействием цГМФ открываются специальные циклонуклеотидзависимые каналы (ЦНЗ-каналы), проницаемые для ионов Na⁺ и Ca²⁺ (рис. [1418] ____). Мы еще встретимся с другими разновидностями ЦНЗ-каналов при рассмотрении вкусовой и обонятельной рецепции. В темноте, когда концентрация цГМФ, синтезируемого гуанилатциклазой в цитоплазме, относительно высока, каналы поддерживаются в открытом состоянии, и через мембрану наружного сегмента непрерывно течет деполяризующий ток – это так называемый темновой ток. При освещении фоторецепторов концентрация цГМФ падает, ЦНЗ-каналы закрываются и фоторецептор гиперполяризуется. Следовательно, реакцией на свет является гиперполяризация фоторецепторов, что отличает их от прочих разновидностей рецепторов.

Несколько странным может показаться то, что большая часть ЦНЗ-каналов уже закрыта в темноте (по разным оценкам, от 90 до 99%), а освещение вызывает закрывание в пределах оставшейся небольшой части открытых каналов. Возможно, такая избыточность обеспечивает линейность зависимости между концентрацией цГМФ и суммарной проводимостью ЦНЗ-каналов.

Следует заметить, что рассмотренный выше механизм относится только к фоторецепторам позвоночных. У беспозвоночных G-белковая система в ответ на воздействие света активирует фосфолипазу C, которая через синтез инозитол-трифосфата вызывает выделение Ca²⁺ из внутриклеточных резервуаров. Это, в свою очередь, ведет через пока не известный механизм к открыванию каналов в наружной мембране, проницаемых для Na⁺ и других катионов. Таким образом, у беспозвоночных освещение ведет к деполяризации фоторецепторов.

В условиях темновой адаптации палочка способна ответить всего на один квант света. Такая беспрецедентная чувствительность достигается за счет того, что в рассмотренную нами цепочку событий включено несколько усилительных каскадов. Одна активированная молекула опсина успевает до своей инактивации провзаимодействовать с несколькими сотнями молекул трансдуцина, а каждая молекула фосфодиэстеразы – гидролизовать по несколько сотен молекул цГМФ. Кроме того, очевидно, что каждый открытый канал способен пропустить множество ионов, а блокирование канала, соответственно, не пропускает их в клетку. Расчеты показывают, что один фотон в конечном счете блокирует прохождение 10⁶- 10⁷ ионов Na⁺, что ведет к генерации рецепторного потенциала примерно в 1 мВ. Заметим, что для детекции света на поведенческом уровне иногда может быть достаточно всего нескольких фотонов, подействовавших одновременно на небольшую область сетчатки (хотя одного фотона, увы, для этого недостаточно).

Хотя начальные стадии стереоизомеризации ретиналя, критичные для фототрансдукции, происходят в пределах одной миллисекунды, дальнейшие процессы, опосредованные G-белковой системой, не могут быть столь быстрыми. Для инициации рецепторного потенциала требуется как минимум несколько десятков миллисекунд, а все реакция на короткую вспышку света занимает несколько сотен миллисекунд (рис. [1419] ____).

Завершающий этап каскада процессов фоторецепции состоит в модулировании выделения медиатора (глутамата) из ножек фоторецепторов на дендриты биполярных и горизонтальных клеток. Как и в других вторичночувствующих рецепторах, скорость выделения медиатора зависит от градуальных изменений рецепторного потенциала. Фоторецепторы позвоночных уникальны в том отношении, что рецепторный потенциал в них – гиперполяризационный, и ему сопутствует ослабление выделения медиатора.

 

Адаптация в фоторецепторах. Система трансдукции должна иметь сопряженный с ней механизм адаптации. Адаптация в данном случае, как и в случае других сенсорных систем, является механизмом подстройки "нулевой" точки измерений, позволяющим реагировать на изменения освещенности в широком диапазоне значений самой освещенности. Базовый механизм адаптации в наружных сегментах фоторецепторов достаточно прост и, как во многих других аналогичных случаях, связан с ионами Ca²⁺. В покое в цитоплазме фоторецепторов, как и в любой другой клетке, поддерживается очень низкая концентрация этих ионов. Это обеспечивается рядом механизмов, в том числе работой ионообменных насосов, которые откачивают наружу ионы Ca²⁺, используя для этого энергию градиентов K⁺ и Na⁺.

Как уже было сказано выше, цГМФ, необходимый для поддержания ЦНЗ-каналов в открытом состоянии, синтезируется гуанилатциклазой. Она, в свою очередь, работает лишь при условии, что ее активирует специальный белок GCAP[4] (рис. [1420] ____). Однако этот белок тормозится ионами Ca²⁺, входящими в цитоплазму через ЦНЗ-каналы. Таким образом, если при воздействии света ЦНЗ-каналы закрываются, то вход ионов Ca²⁺ прекращается, снимается тормозящее действие Ca²⁺ на GCAP, который начинает активировать гуанилатциклазу. В результате концентрация цГМФ начинает расти, а ЦНЗ-каналы – открываться, восстанавливая деполяризованное состояние наружного сегмента фоторецептора. Наоборот, в отсутствии света, когда ионы Ca²⁺ поступают в цитоплазму, GCAP заторможен, он не активирует гуанилатциклазу, и избыточного синтеза цГМФ в темноте не происходит. Такая простая система отрицательной обратной связи способна эффективно подстраивать состояние фоторецептора под текущую освещенность и готовить его к детекции ее изменений.

 

Фотопигменты колбочек. Процессы трансдукции в колбочках практически такие же, как и палочках, хотя чувствительность колбочек к свету несколько хуже, чем у палочек. Благодаря колбочкам мы обретаем цветовое зрение, которое несет несравненно больше информации об окружающем мире, чем монохромное. Основу цветового зрения составляет наличие нескольких разных типов колбочек с разными зрительными пигментами.

В каждом типе колбочек содержится только одна разновидность пигмента, который в колбочках называется йодопсином (iodopsin, от греч. ioeides подобный цвету фиалки и ops глаз, ópsis зрение) и аналогично родопсину, является результатом соединения ретиналя и опсина. Обратите внимание на то, что во всех фотопигментах хромофор один и тот же (ретиналь), а разница в спектре поглощения определяется его белковой частью, т.е. опсином. Соответственно, опсин палочек иногда называют род-опсином (от английского слова "rod", т.е. палочка – не путать с родопсином!), а опсин колбочек – кон-опсином (от английского слова "cone", т.е. колбочка). Ретиналь присоединяется ко всем опсинам в одном и том же месте, а различия состоят в том, какова геометрия зарядов, окружающих молекулу ретиналя.

В сетчатке приматов обнаруживаются три типа колбочек, содержащих разные зрительные пигменты, т.е. эти животные и человек в норме являются трихроматами. Максимумы поглощения трех йодопсинов приматов составляют 419, 531 и 559 нм, что условно считается синим, зеленым и красным цветами (на самом деле, последний цвет ближе к желтому, но его традиционно называют красным, так как только данный зрительный пигмент высоко чувствителен к красному цвету). Нередко их называют коротковолновым, средневолновым и длинноволновыми опсинами соответственно, чтобы избежать путаницы с точным названием цветов (рис. [1421] ____).

Обратите также внимание, что спектры поглощения всех трех йодопсинов довольно широкие. Это означает, что каждая отдельная колбочка реагирует на свет в широком диапазоне длин волн и по ее активности совершенно нельзя судит о цвете стимула. Кроме того, спектры поглощения всех трех типов пигментов сильно перекрываются, и по этой причине видимый свет с любой длиной волны воздействует на два или сразу на все три типа колбочек, но в разной степени. Таким образом, сравнивая активность в трех типах колбочек с дискретными видами фотопигментов, можно различать цвета во всем непрерывном спектре видимого света и множество цветовых оттенков.

Зрительные пигменты других животных могут иметь несколько отличающиеся максимумы спектров поглощения. Многие позвоночные, за исключением млекопитающих, имеют четвертый тип колбочек, чувствительный к ближнему ультрафиолету (у птиц максимум его поглощения составляет 370 нм) – соответственно, они являются тетрахроматами. Наоборот, большинство млекопитающих, за исключением приматов, обладают всего двумя типами колбочек; например, у собаки всего два вида йодопсина с максимумами поглощения 450 и 555 нм, т.е. они дихроматы. Заметим, что чем больше типов колбочек, тем больше вариаций цветовых оттенков можно различить. Различия в количестве и свойствах йодопсинов у разных видов животных особенно важно учитывать в тех случаях, когда в эксперименте им предъявляют цветовые стимулы на экране стандартных мониторов, которые изначально сконструированы инженерами в расчете на человеческое восприятие. Более корректный метод изучения цветового зрения у животных основан на применении монохроматического света, получаемого с помощью специальных светофильтров или призм. Далее мы еще вернемся к специфике цветового зрения, для понимания которого мы должны изучить многие другие аспекты строения и физиологии зрительной системы.

Все опсины состоят в родстве друг с другом, хотя разделение одного общего предкового гена, кодирующего исходный опсин, на два произошло не менее 500 млн. лет назад. Родопсин палочек, видимо, произошел от зеленого опсина колбочек. Млекопитающие в ходе ранних этапов своей эволюции сохранили только два гена кон-опсинов – синий и красный. Приматы заново приобрели зеленый опсин путем мутации в гене красного опсина. Можно предположить, что третий пигмент возник и закрепился в эволюции потому, что позволял уверенно отличать красный и желтый цвета, характерные для спелых плодов, от зеленого цвета незрелых плодов.

 

Аномалии, связанные с отсутствием или дефектами зрительных пигментов у человека. В норме мы воспринимаем цвет за счет того, что обладаем тремя разными видами йодопсина, т.е., как и все приматы, является трихроматами. Изредка встречаются рецессивные мутации генов отдельных типов йодопсина, два из которых располагаются в X-хромосоме – по этой причине аномалии цветового зрения наблюдаются у мужчин значительно чаще, чем у женщин. Мутация может привести к тому, что колбочки одного типа начинают хуже воспринимать цвет, и человек искаженно воспринимает цвета (аномальная трихромазия). Соответствующие проявления называются протаномалией, дейтераномалией и тританомалией при нарушении работы красного, зеленого и синего пигментов соответственно.

Если один вид колбочек становится полностью нефункциональным, то возникает дихромазия; при этом говорят о протанопии, дейтеранопии и тританомалии – т.е. отсутствии красного, зеленого и синего пигментов соответственно. Дихромазию впервые описал в 1794 Дж. Дальтон, который сам страдал этим недостатком, поэтому ее иногда называют дальтонизмом (впрочем, это слово редко используется как термин). Дихромат различает намного меньше оттенков, чем здоровый человек, а часть спектра кажется ему ахроматической, переходящей в черный цвет. Чаще встречаются нарушения в работе красного и зеленого пигмента; при протанопии и дейтеранопии человек не может различить красный и зеленый цвета (что, естественно, является противопоказанием для вождения машины), а протаноп вообще не воспринимает красный цвет в самой длинноволновой части спектра. При очень редко встречающейся тританопии человек путает желтый и синий цвета, а фиолетовый цвет кажется ему черным.

Аномалии цветового зрения встречаются примерно у 8% мужчин и у 0,5% женщин; будучи врожденным генетическим заболеванию, лечению они не полежит. Аномалии цветового зрения легко выявляются с помощью набора «псевдоизохроматических» таблиц Исихары, представляющих собой группы хаотически разбросанных кружков разного цвета. Цвет кружков немного различается, и при нормальном зрении можно увидеть, как из них складываются цифры. При различных видах цветовой слепоты человек оказывается неспособен выделить некоторые цифры из фона, отличающегося от них по цветовому оттенку.

Очень небольшое количество людей (менее 0,01%) являются монохроматами – они видят мир полностью черно-белым. Глаза таких людей плохо переносят яркий свет, а острота их зрения в области фовеа снижена. Гистологическое строение сетчатки у них при этом не отличается от нормы. Предположительно, в этом случае в колбочках вместо йодопсина присутствует родопсин. Встречается и нарушение работы палочковой системы, или никталопия (называемая также "куриной слепотой"), при которой человек нормально видит и различает цвета лишь в условиях хорошего освещения, но его глаз не адаптируется к пониженной освещенности.

 

Светочувствительность ганглиозных клеток. Сравнительно недавно было открыто, что в глазах млекопитающих, включая человека, присутствует еще один зрительный пигмент – меланопсин, уже известный науке как фоточувствительный пигмент меланофоров. Еще более удивительно то, что этот фотопигмент содержится не в "традиционных" фоторецепторах – палочках и колбочках, а непосредственно в одной разновидности ганглиозных клеток, т.е. выходных элементов сетчатки, аксоны которых образуют зрительный нерв. Данная популяция ганглиозных клеток уникальна еще тем, что проецируется в супрахиазматическое ядро гипоталамуса, образуя прямой ретиногипоталамический тракт, а также отчасти в претектальную область среднего мозга. Супрахиазматическое ядро гипоталамуса играет важнейшую роль в подстройке суточного ритма в соответствии со временем суток, которое оценивается, прежде всего, по общей освещенности. Показано, что даже при полном отсутствии пигментов палочек и колбочек животные все равно остаются способными подстраивать свой циркадный ритм под чередование светлого и темного времени суток. Претектальная область проецируется на ядро Эдингера-Вестфаля и участвует в дуге зрачковых рефлексов, которые также являются реакцией на общую освещенность. Таким образом, собственная фоточувствительность ганглиозных клеток, опосредованная меланопсином, задействована в таких задачах, в которых требуется лишь оценка количества света, попадающего в глаза – без формирования и анализа изображения как такового.