Простые методы окраски микробов

В лабораторной технике пользуются простыми и сложными методами окраски микробов. Простым методом окраски называют окраску препарата одной какой-либо краской. К таким методам относится окраска разведенным фуксином или щелочной метиленовой синькой.

Окраска разведенным фуксином. На предметном стекле готовят мазок и фиксируют его на пламени горелки. Затем на охлажденный препарат на 1—2 минуты наливают разведенный фуксин. Краску промывают водой и препарат высушивают.

Окраска щелочной метиленовой синькой. На предметном стекле готовят мазок и фиксируют его на огне. На остывший мазок наливают метиленовую синьку на 2—3 минуты. Краску смывают водой и препарат высушивают. При окраске синькой дифференцируются ядро и цитоплазма, а потому при окраске материала (гной, экссудат и т. д.) целесообразнее употреблять метиленовую синьку.

СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ

При сложных методах окраски микробов на один и тот же препарат воздействуют несколькими растворами. К сложным методам относится окраска по Граму, Циль-Нильсену, по Нейссеру и т. д

Окраска микробов по методу Грама (Кристиан Грам, 1884). Все микробы по их отношению к окраске по методу Грама делятся на две группы:

а) грампозитивные, или грамположительные;

б) грамнегативные, или грамотрицательные.

Различное отношение к окраске по Граму зависит от разницы в физическом и химическом строении самих бактерий. Для окраски по классическому методу Грама необходимы следующие растворы

1) карболовый генцианвиолет;

2) раствор Люголя (иод кристаллический 1 г, йодистый калий 2 г и дистиллированная вода 300 мл; иод и йодистый калий смешивают и растворяют в 5 мл воды, а затем добавляют остальную воду);

3) спирт 96°;

4) разведенный фуксин

Техника окраски по Граму следующая. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, по размеру равный сделанному мазку. На эту бумажку наливают раствор генцианвиолета на 1—2 минуты. Сливают краску с бумажкой и, не промывая препарат водой, наливают на 1—2 минуты раствор Люголя до полного почернения мазка. Затем раствор Люголя сливают и на 1/2—1 минуту наливают 96° спирт (при этом препарат надо покачивать). Промывают водой и дополнительно окрашивают разведенным фуксином (1—2 минуты). Сливают краску, промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Видоизмененный способ Грама (по А. Синеву). 1. На фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумажки, пропитанной 1 % спиртовым раствором генцианвиолета.

2. Наносят на бумажку 2—3 капли воды и оставляют на 2 минуты.

3. Снимают бумажку пинцетом и наливают раствор Люголя на 1—2 минуты.

4. Обесцвечивают спиртом (10—30 секунд).

5. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином (1—2 минуты).

Образующийся красящий комплекс генцианвиолет + йод окрашивает клетки в фиолетовый цвет. Если клетки не обесцвечиваются спиртом то они сохраняют эту окраску и являются грамположительными (Гр+). Если же при обесцвечивании спиртом клетки теряют красящий комплекс – они считаются грамотрицательными (Гр-).

Окраска кислотоустойчивых микробов. Способы окраски кислотоустойчивых микробов основаны на их способности окрашиваться сильно красящими растворами красок при нагревании. При последующем действии слабых кислот они не обесцвечиваются. Благодаря такой обработке, кислотоустойчивые микробы могут быть дифференцированы от других бактерий. Наиболее употребительна окраска по Циль-Нильсену. Техника окраски следующая.

1) На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, на которую наносят карболовый фуксин и препарат окрашивают при нагревании до появления паров, после чего оставляют краску еще на несколько минут и дают препарату остыть

2) Сливают краску и промывают препарат водой.

3) Обесцвечивают 5% серной кислотой (10—30 секунд).

4) Промывают водой.

5) Промывают чистым спиртом 10—15 секунд.

6) Спирт смывают водой.

7) Докрашивают синькой Леффлера в течение 3—5 минут.

Обесцвечивание препарата можно также произвести 3% солянокислым спиртом.

При этом методе окраски туберкулезные микробы окрашиваются в рубиново красный цвет, а другие, некислотоустойчивые микробы — в синий цвет.

Окраска спор. Способ Ожешко. На краю предметного стекла делают мазок из культуры, просушивают его и, не фиксируя, погружают на 2—3 минуты в чашку с кипящей 1% соляной кислотой, которая действует в качестве протравы. (Иногда соляную кислоту наносят на препарат и прогревают в пламени горелки до появления паров). После этого мазок промывают водой, обсушивают, фиксируют и красят карболовым фуксином через фильтровальную бумагу с подогреванием. Затем препарат обесцвечивают 5% серной кислотой и докрашивают дополнительно метиленовой синькой в течение 3—5 минут: споры, стойко прокрасившиеся фуксином, окрашены в яркокрасный цвет; вегетативные тела бактерий, обесцветившиеся в результате воздействия на фуксин серной кислоты, окрашены в дополнительный синий цвет.

Негативные способы окраски препаратов. При этих способах исследуют микробов в неокрашенном виде, в то время как весь фон препарата окрашен каким-либо веществом, которое при приготовлении мазка распределяется на стекле вокруг микробов, но не адсорбируется ими. На окрашенном фоне ярко выделяются неокрашенные тела микробов, с точно обрисованными контурами.

Способ Бурри. Исследуемый материал смешивают с тушью; следовательно, микробы рассматриваются на черном фоне. Мазок приготовляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю туши, а рядом с ней — каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно, но быстро (чтобы не дать им высохнуть) перемешивают. Из полученной смешанной капли приготовляют мазок обычным способом. Когда мазок высохнет, его фиксируют в пламени горелки и рассматривают его с иммерсионной системой. Микробные клетки обнаруживаются в виде ярко освещенных телец на темном фоне. Для ознакомления с техникой окраски по Бурри можно приготовить мазок из зубного налета, где всегда имеется много разнообразных микробов. В каплю воды, помещенную у края предметного стекла, погружают небольшой кусочек зубного налета, взятого простерилизованной и остуженной петлей у шейки зуба, и равномерно эмульгируют его в капле. Затем рядом с каплей воды помещают каплю туши. Обе капли тщательно смешивают петлей и из этой смеси делают мазок подобно мазку из капли крови. При микроскопировании наблюдается характерная флора зубного налета.

Окраска жгутиков. Приготовление мазка для окраски жгутиков производится с соблюдением некоторых предосторожностей. Платиновой петлей только прикасаются к поверхности 12—20-часовой агаровой культуры, но петлей не проводят по поверхности агара; затем платиновую петлю вносят в пробирку с 2—3 мл стерилизованной водопроводной воды и, не взбалтывая, держат неподвижно в воде 1—2 минуты. Вынув петлю, пробирку оставляют стоять 15 минут для более равномерного распределения микробов в воде. Каплю такой суспензии наносят на совершенно чистое предметное стекло, обработанное по специальному способу. Препараты фиксируют на огне и окрашивают специальными способами, причем перед окраской обрабатывают протравой, которая усиливает действие краски.

Выявление жгутиков свидетельствует, прежде всего, о способности микроорганизмов к активному движению. Лишь в исключительных случаях есть надобность окрашивать жгутики для решения вопроса о принадлежности к тому или иному виду. Поэтому о подвижности микробов обычно судят используя методы посева в различные среды, как правило, полужидкие. Это и быстрее и проще.

Окраска по Романовскому-Гимза. Краска Романовского-Гимза — смесь азура (органическая краска, получаемая из метиленовой синьки), эозина и метиленовой синьки. Будучи в растворе синего цвета, она окрашивает клеточную плазму в голубой цвет, а ядра клеток, зернистость, слизь, капсулы бактерий—в красно-фиолетовый цвет.

Окраска по Романовскому-Гимза является одним из основных методов при изучении морфологии простейших кровепаразитов, спирохет, а также при исследовании форменных элементов крови.

Способ применения. К 10 мл дестиллированной воды нейтральной или слабо щелочной реакции непосредственно перед окраской препарата прибавляют 10 капель краски и тотчас же наливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с водой). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют. Качество окраски зависит от свойств воды и надо проверять ее реакцию.