Стерилизация (обеспложивание) - полное уничтожение М. О. , их спор и всего живого в питательной среде, материале, посуде, инструментах и других предметах лабораторного обихода.

РИСУНОК 1

Пастеровские пипетки. Стеклянную трубку диаметром 5—6 мм вносят в пламя горелки, нагревают до размягчения стекла и, вынув из пламени, аккуратно растягивают концы трубки в разные стороны.

Микробиологические петли. Берут отрезок платиновой или нихромовой проволоки (10—12 см. длиной) и при помощи пинцета на одном конце делают петлю диаметром 4-5 мм. Затем один конец стеклянной палочки сильно расплавляют на большом огне и к нему припаивают заготовленную вышеуказанным образом проволоку. Вместо стеклянной палочки часто используют специальный держатель. Стерилизуют непосредственно перед работой в пламени горелки.

Стеклянный шпатель. Стеклянную палочку необходимой толщины вводят в пламя горелки, нагревают до размягчения, конец обжимают предварительно нагретыми плоскогубцами, сгибают два раза, образуя треугольник. Стерилизуют перед работой в пламени горелки.

Физиологический раствор. На 1 л дистиллированной воды берут 8,5 г поваренной соли, растворяют и фильтруют через бумажный фильтр. Затем разливают во флаконы и стерилизуют автоклавированием.

Пробирки, колбы, матрацы и другие емкости для культивирования микробов, перед стерилизацией закрывают ватными пробками, а иногда дополнительно заворачивают в бумагу.

Чашки Петри  заворачивают в бумагу по одной или помещают в большую закрывающуюся емкость и автоклавируют.

Пипетки. В микробиологической лаборатории широко пользуются пипетками. Пипетки бывают пастеровские и градуированные. Первые не имеют делений, и расчет жидкости при работе с ними ведется на капли; вторые имеют деления, и количество вытекающей из них жидкости определяется более точно. Отсчитывание измеряемой жидкости производится по делениям сверху вниз (так, например, если нужно градуированной пипеткой в 5 мл отмерить 3,5 мл, то набирают жидкость до 0, а затем выливают до 3,5).

При подготовке к стерилизации в верхний, широкий конец пипетки вкладывают кусочек ватки, которая в дальнейшем будет служить фильтром в случае вытекания суспензии из пипетки в грушу. Пипетки заворачивают в бумагу или помещают в закрываемый цилиндр. После работы пипетки погружают в стерилизующий раствор на 2-3 см. выше уровня насасывания бактериальной суспензии.

 

 

ЗАНЯТИЕ 2. Бактериологический анализ: основные этапы. Питательные среды: классификация, приготовление и состав. Методы взятия проб. Посев микрофлоры воздуха.

 

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ – ИЗУЧЕНИЕ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА МИКРОФЛОРЫ ТОГО ИЛИ ИНОГО ОБЪЕКТА.

При проведении бактериологического анализа можно выделить три основных этапа: 1) взятие пробы; 2) выделение чистых культур; 3) идентификация выделенных культур. Все эти этапы предполагают те или иные действия с микроорганизмами, культивирование которых производят с использованием питательных сред.

Питательная среда – субстрат содержащий все необходимые для развития микроба компоненты и отвечающий определенным требованиям (см. ниже). Выращивание м.о. в искусственных условиях получило название культивирование.

Питательные среды делятся по назначению, происхождению и консистенции.

По происхождению:

естественные и искусственные (из искусственных выделяют в особую группу синтетические среды, их готовят из химически чистых веществ солей, углеводов, аминокислот и др., взятых в определенных соотношениях).

По консистенции:

жидкие: мясная вода, МПБ, бобово-пептонный бульон и др.

полужидкие: готовятся на основе жидких путемдобавления 0,25% агара.

плотные: МПЖ, МПА (готовятся - к жидкой среде добавляется 10-15% желатины или 1,5-2% агара).

По назначению:

Простые (обычные) - применяются для выращивания большинства м.о.: МПБ, МПА, МПЖ и др.

Элективные - пригодные для выращивания одного приспособленного к данным условиям вида м.о. Сопутствующие м.о. или не растут на такой среде или развитиеих сильно задерживается. Пример - щелочно-пептонная вода (для холерного вибриона); среда Эшби для азотобактера.

Дифференциально-диагностические - применяются для изучения биохимических свойств микробов, а в особых случаях для выделения чистых культур некоторых микроорганизмов. Среды Гисса - жидкие среды с углеводами; среда Эндо - плотная среда с индикатором для кишечной палочки.

 

ТРЕБОВАНИЯ, КОТОРЫМ ДОЛЖНА УДОВЛЕТВОРЯТЬ ВСЯКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА.

1. Содержать необходимые для м.о. питательные вещества: источники азота, углерода, кислорода, водорода и неорганические соли; факторы роста;

2. Быть стерильной, т.е. не содержать никаких посторонних м.о.;

3. Быть достаточно прозрачной, что обеспечит хорошее наблюдение за характером роста культуры и теми изменениями, которые происходят в среде в результате роста микроорганизмов;

4. иметь соответствующую реакцию среды.

 

О СРЕДАХ:

Обычные - МПБ- жидкая среда, относящаяся к искусственным питательным средам (готовится из мясо-пептонного бульона + соли + пептон + фосфатные буферные смеси для стабилизации рН.). Такой МПБ пригоден для выращивания большинства бактерий. Из него легко приготовить ряд сред специального назначения.

МПА - готовятся из МПБ + 1-2% агара. МПА содержит много питательных веществ, является основной плотной питательной средой пригодной для выращивания большинства м.о. Агар - вещество полисахаридной природы, получаемое из морской водоросли.

Полужидкие среды: готовятся из МПБ + 0,25% агара, используются редко, в частности для изучения подвижности микроорганзмов.

Сыпучие среды - готовые в виде порошка.

Элективные - применение их основано на свойствах некоторых организмов потреблять определенные вещества. Среда Эшби - для азотофиксирующих микроорганизмов, в частности для p. Azotobacter spp. Элективность этой среды заключается в том, что онане содержит N₂ (а N₂ необходим м.о.). На этой среде культивируются м.о., которые могут фиксировать N₂ из воздуха (азотфиксаторы).

Щелочно-пептонная вода - для холерных вибрионов. Элективность этой среды заключается в том, что холерные вибрионы развиваются только в щелочных условиях. Применение элективных сред позволяет выделить чистые культуры м.о. Открыл элективные среды Виноградский. Им разработаны основные методы выделения чистых культур.

Дифференциально-диагностические - применениеих основано на различной биохимической активности м.о. Биохимическая активность определяется по наличию ферментов, расщепляющих те или иные соединения, например сахара (как в случае сред Гисса). Среды Гисса – т.н. " пёстрый ряд" или классические - готовятся из МПБ + индикатор рН + углевод; разливаются в пробирки с поплавком. Пример:имеем несколько пробирок 1) глюкоза; 2) сахароза; 3) лактоза и т.д. В эти пробирки производят посев одной и той же культуры. Известно, что данная культура расщепляет только глюкозу и лактозу, при этом цвет среды изменяется (среда подкисляется). По изменению цвета среды определяют способность м.о. расщеплять сахара. Если в процессе расщепления углеводов образуется газ (СО₂), то поплавок всплывает на поверхность среды.

Среда Эндо - плотная среда для бактерий кишечной группы, содержит лактозу - которую расщепляют только кишечные бактерии. Кишечная палочка на этой среде образует, в частности крупные колонии малинового цвета с металлическим блеском, а среда вокруг них изменяет цвет до малинового. Дизентерийная палочка образует полупрозрачные голубоватые колонии, и среда цветне изменяет. Для обнаружения разных м.о. используют различные среды исходя из особенностей их обмена веществ.

Но не все микроорганизмы можно выращивать в искусственных условиях. В этом отношении вирусы и риккетсии отличаются от всех других м.о.: будучи облигатными (обязательными) паразитами, они не способны размножаться вне бактериальной клетки.

 

 

МЕТОДЫ ВЗЯТИЯ ПРОБ

 

ПОСЕВ МИКРОФЛОРЫ ВОЗДУХА

 

Одним из простейших методов взятия проб воздуха является метод седиментации

 

3. Выделение чистых культур микроорганизмов. Посев на скошенный МПА. Изучение культуральных и морфологических свойств микробов. Основные морфологические формы бактерий. Методы приготовления и окрашивания фиксированных препаратов. Простые и сложные методы окрашивания препаратов.

 

Выше мы уже отметили, что проведение бактериологического анализа предполагает определение видовой принадлежности выделенных культур – их идентификацию. Однако прежде необходимо получить чистые культуры микроорганизмов.

Чистой культурой микроба называется такая культура, которая состоит из особей только одного определенного вида. Во внешней среде и в организме человека микробы чаще всего встречаются в смеси с другими микробами. Для изучения свойств того или иного микроба (без чего не может быть поставлен диагноз) его нужно иметь в чистой культуре, т. е. приходится отделять его от других микробов, с которыми он смешан. Методов выделения чистых культур существует в основном три: а) посев на чашку Петри, б) посев на элективную (избирательную) среду, в) выделение культуры из организма животного, чувствительного к тому или иному микроорганизму.

Посев в чашку Петри имеет целью получить изолированные друг от друга совокупности клеток, определенного вида, - колонии. Посев производят разными способами: либо петлей, либо стеклянным шпателем (шпатель Дригальского). Посев петлей производят следующим образом. Берут петлей небольшое количество культурального материала, легко проводят по поверхности агара нанося ряд линий. Той же петлей, не набирая материала вновь наносят штрихи на второй и третьей чашке с агаром. На первой чашке может получиться сплошной рост, тогда как на второй и на третьей наблюдается рост единичных, изолированных колоний. Каждая колония представляет обособленное скопление однородных клеток микробов. При последующем пересеве из колоний на косой агар или другую питательную среду получают чистую культуру

РИСУНОК111115

РИСУНОК 16

При посеве шпателем на поверхность агара наносят петлей одну каплю исследуемого материала. Затем, приоткрыв чашку, прокаленным и остуженным стеклянным шпателем размазывают каплю по всей поверхности, производя легкие поглаживающие движения во все стороны по поверхности агара. Не обжигая шпателя, им же засевают вторую и третью чашку. Для получения относительных количественных характеристик исследуемой суспензии на поверхность среды наносят мерное количество бактериальной суспензии с определенной концентрацией клеток. Для этого используют мерные пипетки. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микроорганизмов, тогда как в последующих - изолированные колонии.

РИСУНОК 12

После посева чашки помещают в термостат крышками вниз, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри при застывании агара, не помешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1-7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов. Отдельно выросшие колонии пересевают бактериологической иглой, простерилизованной в пламени горелки и остуженной на воздухе, на свежую стерильную среду (чаще всего скошенный агар в пробирке).

Изолированные колонии анаэробных микроорганизмов получают методом глубинного посева, известного как метод последовательных разведений. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15-20 мл и стерилизуют. Непосредственно перед посевом пробирки помещают в кипящую водяную баню, чтобы из среды удалить кислород. Высев в пробирки производят из нескольких последовательных разведений бактериальной суспензии в стерильной водопроводной воде. Для этого в пробирку с расплавленной и остуженной до 48-50° агаризованной средой вносят 0, 5-1, 0 мл одного из разведений бактериальной суспензии. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями. Затем около пламени горелки вынимают из пробирки пробку, обжигая края пробирки в пламени горелки, и быстро выливают содержимое пробирки в чашку Петри. После того, как агаризованная среда застынет, чашки Петри помещают в термостат. Колонии выросшие в толще среды, вырезают стерильным скальпелем или извлекают стерильными капиллярными трубками, или простой петлей и переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР. Для классификации и идентификации культур выделенные микробы подвергаются детальному изучению. Характеристика данного микроба складывается из морфологических (1), культуральных (2), биохимических и серологических (3) признаков, которые позволяют его идентифицировать, т. е. определить его видовую принадлежность.

Морфологические свойства определяются путем бактериоскопии окрашенных мазков и изучения микробов в живом виде (висячая капля). При микроскопировании обращают внимание на форму микроба, его расположение, величину, наличие спор, капсул, отношение к тем или иным методам окраски.

Культуральные свойства – это морфологические свойства совокупности клеток микроорганизмов, выросшей на определенном субстрате. Обращают внимание на форму и размер колоний, их цвет, консистенцию и др.

Биохимические свойства. Для более точного определения вида применяют более тонкие исследования, т. е. изучают биохимические свойства микробов. При этом определяют отношение микроба к кислороду, его ферментативные и редуцирующие свойства, образование в культурах определенных продуктов обмена и изменение реакции среды.

 

ОСНОВНЫЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ГРУППЫ БАКТЕРИЙ. Бактерии представляют собой микроскопические организмы, измеряемые микронами (микрон равен 0,001 мм). Размножаются при помощи простого поперечного деления. Величина бактерий незначительна, в среднем она колеблется от 0,5 до б мкм. В капле воды может находиться несколько миллионов микробов. Бактерии по своей форме разделяются на три основные группы, хотя их морфологическое разнообразие значительно богаче. К первой группе относятся микробы, имеющие шаровидную форму, — кокки, ко второй — имеющие форму палочек, т. е. микробы, у которых длина больше, чем ширина. Наконец, к третьей группе относятся извитые формы — вибрионы, спирохеты и спириллы.

а) Кокки имеют форму шара. В процессе деления новые молодые клетки могут образовывать специфические скопления. По взаимному расположению клеток кокки подразделяются на следующие морфологические группы (рис. 1):

- монококки – клетки располагающиеся по одной, изолированно друг от друга;

- диплококки, или парные кокки, – клетки, располагающиеся попарно;

- стрептококки — соединение отдельных кокков в виде цепочек;

- сарцины — группа кокков, клетки которых образуют плотно упакованные угловатые скопления, напоминающие кубики или перевязанные тюки;

- стафилококки — скопление кокков, напоминающее виноградные кисти или рассыпанный виноград.

Однако среди кокков встречаются такие, которые не имеют форму правильных шаров. Так, возбудитель гонорреи — гонококк — имеет бобовидную форму, возбудитель крупозного воспаления легких — пневмококк — ланцетовидную форму. Кроме того необходимо отметить что форма клеток многих бактерий может меняться в зависимости от их физиологического состояния.

РИСУНОК 2

Рис. 2. Бактерии. Круглые формы.

1 — микрококки; 2 — диплококки; 3 — стрептококки; 4 — тетракокки; 5 — сарцины; 6 — стафилококки.

б) Палочки. К. этой группе относятся микробы, имеющие форму цилиндрических клеток. Те из них, которые образуют споры, называются бациллами, не образующие спор — бактериями. Палочки, подобно коккам, могут давать различные сочетания: палочки, соединенные по две, носят название диплобацилл, или диплобактерий; палочки, соединенные в цепочку, образуют стрептобациллы, или стрептобактерии (рис. 3).

РИСУНОК 3

 

Рис.3

 

У одних палочек концы закругленные, у других— прямые, у третьих — заостренные. Спорообразующие бактерии могут различаться по форме и расположению споры в клетке, по образующемся или нет вздутию клетки вокруг споры и т.д. Так, можно различать округлые и эллипсовидные споры, расположенные терминально, субтерминально и центрально.(Рис.4)

 

РИСУНОК 4 СПОРЫ

 

Рис.4 терминальное          субтерминальное           центральное

 

 

в) К третьей группе относятся бактерии, извитые в виде спирали. Среди них различают палочки, слегка изогнутые в виде запятой — вибрионы; спирально извитые микроорганизмы —спириллы и спирохеты (рис. 4).

РИСУНОК 5

 

Рис. 5. Извитые формы.

1 — холерный вибрион; 2 — спирилла; 3 — спирохета возвратного тифа; 4 — спирохеты сифилиса.

 

Полиморфизм бактерий. Форма и величина бактерий могут меняться в зависимости от условий питания, культивирования и воздействия различных физических и биохимических факторов. Так, например, холерный вибрион в старых культурах может принимать форму шаров, гигантских спирилл, амеб и т. д. Туберкулезная палочка обладает склонностью давать ветвистые формы, а дифтерийной палочке свойственно ветвление и образование на концах булавовидных вздутий. Такое отклонение от обычной формы и размера у микробов носит название полиморфизма.

РИСУНОК6 РИСУНОК 7

Однако, прежде чем изучать морфологические свойства бактерий, обычно исследуют культуральные признаки и отсевают клетки в стерильную среду для дальнейшего культивирования. Это продиктовано тем, что для приготовления препарата приходится многократно открывать емкости в которых развиваются колонии бактерий, а это неминуемо способствует проникновению посторонних микробов и загрязнению исследуемых культур.

 

СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ

При сложных методах окраски микробов на один и тот же препарат воздействуют несколькими растворами. К сложным методам относится окраска по Граму, Циль-Нильсену, по Нейссеру и т. д

Окраска микробов по методу Грама (Кристиан Грам, 1884). Все микробы по их отношению к окраске по методу Грама делятся на две группы:

а) грампозитивные, или грамположительные;

б) грамнегативные, или грамотрицательные.

Различное отношение к окраске по Граму зависит от разницы в физическом и химическом строении самих бактерий. Для окраски по классическому методу Грама необходимы следующие растворы

1) карболовый генцианвиолет;

2) раствор Люголя (иод кристаллический 1 г, йодистый калий 2 г и дистиллированная вода 300 мл; иод и йодистый калий смешивают и растворяют в 5 мл воды, а затем добавляют остальную воду);

3) спирт 96°;

4) разведенный фуксин

Техника окраски по Граму следующая. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, по размеру равный сделанному мазку. На эту бумажку наливают раствор генцианвиолета на 1—2 минуты. Сливают краску с бумажкой и, не промывая препарат водой, наливают на 1—2 минуты раствор Люголя до полного почернения мазка. Затем раствор Люголя сливают и на 1/2—1 минуту наливают 96° спирт (при этом препарат надо покачивать). Промывают водой и дополнительно окрашивают разведенным фуксином (1—2 минуты). Сливают краску, промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Видоизмененный способ Грама (по А. Синеву). 1. На фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумажки, пропитанной 1 % спиртовым раствором генцианвиолета.

2. Наносят на бумажку 2—3 капли воды и оставляют на 2 минуты.

3. Снимают бумажку пинцетом и наливают раствор Люголя на 1—2 минуты.

4. Обесцвечивают спиртом (10—30 секунд).

5. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином (1—2 минуты).

Образующийся красящий комплекс генцианвиолет + йод окрашивает клетки в фиолетовый цвет. Если клетки не обесцвечиваются спиртом то они сохраняют эту окраску и являются грамположительными (Гр+). Если же при обесцвечивании спиртом клетки теряют красящий комплекс – они считаются грамотрицательными (Гр-).

Окраска кислотоустойчивых микробов. Способы окраски кислотоустойчивых микробов основаны на их способности окрашиваться сильно красящими растворами красок при нагревании. При последующем действии слабых кислот они не обесцвечиваются. Благодаря такой обработке, кислотоустойчивые микробы могут быть дифференцированы от других бактерий. Наиболее употребительна окраска по Циль-Нильсену. Техника окраски следующая.

1) На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, на которую наносят карболовый фуксин и препарат окрашивают при нагревании до появления паров, после чего оставляют краску еще на несколько минут и дают препарату остыть

2) Сливают краску и промывают препарат водой.

3) Обесцвечивают 5% серной кислотой (10—30 секунд).

4) Промывают водой.

5) Промывают чистым спиртом 10—15 секунд.

6) Спирт смывают водой.

7) Докрашивают синькой Леффлера в течение 3—5 минут.

Обесцвечивание препарата можно также произвести 3% солянокислым спиртом.

При этом методе окраски туберкулезные микробы окрашиваются в рубиново красный цвет, а другие, некислотоустойчивые микробы — в синий цвет.

Окраска спор. Способ Ожешко. На краю предметного стекла делают мазок из культуры, просушивают его и, не фиксируя, погружают на 2—3 минуты в чашку с кипящей 1% соляной кислотой, которая действует в качестве протравы. (Иногда соляную кислоту наносят на препарат и прогревают в пламени горелки до появления паров). После этого мазок промывают водой, обсушивают, фиксируют и красят карболовым фуксином через фильтровальную бумагу с подогреванием. Затем препарат обесцвечивают 5% серной кислотой и докрашивают дополнительно метиленовой синькой в течение 3—5 минут: споры, стойко прокрасившиеся фуксином, окрашены в яркокрасный цвет; вегетативные тела бактерий, обесцветившиеся в результате воздействия на фуксин серной кислоты, окрашены в дополнительный синий цвет.

Негативные способы окраски препаратов. При этих способах исследуют микробов в неокрашенном виде, в то время как весь фон препарата окрашен каким-либо веществом, которое при приготовлении мазка распределяется на стекле вокруг микробов, но не адсорбируется ими. На окрашенном фоне ярко выделяются неокрашенные тела микробов, с точно обрисованными контурами.

Способ Бурри. Исследуемый материал смешивают с тушью; следовательно, микробы рассматриваются на черном фоне. Мазок приготовляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю туши, а рядом с ней — каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно, но быстро (чтобы не дать им высохнуть) перемешивают. Из полученной смешанной капли приготовляют мазок обычным способом. Когда мазок высохнет, его фиксируют в пламени горелки и рассматривают его с иммерсионной системой. Микробные клетки обнаруживаются в виде ярко освещенных телец на темном фоне. Для ознакомления с техникой окраски по Бурри можно приготовить мазок из зубного налета, где всегда имеется много разнообразных микробов. В каплю воды, помещенную у края предметного стекла, погружают небольшой кусочек зубного налета, взятого простерилизованной и остуженной петлей у шейки зуба, и равномерно эмульгируют его в капле. Затем рядом с каплей воды помещают каплю туши. Обе капли тщательно смешивают петлей и из этой смеси делают мазок подобно мазку из капли крови. При микроскопировании наблюдается характерная флора зубного налета.

Окраска жгутиков. Приготовление мазка для окраски жгутиков производится с соблюдением некоторых предосторожностей. Платиновой петлей только прикасаются к поверхности 12—20-часовой агаровой культуры, но петлей не проводят по поверхности агара; затем платиновую петлю вносят в пробирку с 2—3 мл стерилизованной водопроводной воды и, не взбалтывая, держат неподвижно в воде 1—2 минуты. Вынув петлю, пробирку оставляют стоять 15 минут для более равномерного распределения микробов в воде. Каплю такой суспензии наносят на совершенно чистое предметное стекло, обработанное по специальному способу. Препараты фиксируют на огне и окрашивают специальными способами, причем перед окраской обрабатывают протравой, которая усиливает действие краски.

Выявление жгутиков свидетельствует, прежде всего, о способности микроорганизмов к активному движению. Лишь в исключительных случаях есть надобность окрашивать жгутики для решения вопроса о принадлежности к тому или иному виду. Поэтому о подвижности микробов обычно судят используя методы посева в различные среды, как правило, полужидкие. Это и быстрее и проще.

Окраска по Романовскому-Гимза. Краска Романовского-Гимза — смесь азура (органическая краска, получаемая из метиленовой синьки), эозина и метиленовой синьки. Будучи в растворе синего цвета, она окрашивает клеточную плазму в голубой цвет, а ядра клеток, зернистость, слизь, капсулы бактерий—в красно-фиолетовый цвет.

Окраска по Романовскому-Гимза является одним из основных методов при изучении морфологии простейших кровепаразитов, спирохет, а также при исследовании форменных элементов крови.

Способ применения. К 10 мл дестиллированной воды нейтральной или слабо щелочной реакции непосредственно перед окраской препарата прибавляют 10 капель краски и тотчас же наливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с водой). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют. Качество окраски зависит от свойств воды и надо проверять ее реакцию.

 

КРУГОВОРОТ АЗОТА

Рис. 21. Круговорот азота. Окисление азота показано сплошными стрелками, восстановление — точечными, а реакции без изменения валентности — пунктирными стрелками.

РИСУНОК 21

Связанный азот в форме аммиака, нитрата и органических соединений относительно дефицитен в почве и воде и часто представляет собой фактор, ограничивающий развитие живых организмов. По этой причине циклическое превращение азотистых соединений играет первостепенную роль в снабжении необходимыми формами азота различных по пищевым потребностям организмов биосферы. Основные этапы циклического превращения азота схематически показаны на рис.21.

ФИКСАЦИЯ АЗОТА

Подсчитано, что количество азота, участвующего в круговороте, составляет 10⁸—10⁹ т в год. Тот факт, что в атмосфере имеется неисчерпаемый запас газообразного азота (N₂), тогда как на земной поверхности наблюдается относительный дефицит связанного азота, позволяет предположить, что этапом, ограничивающим скорость круговорота, является процесс фиксации азота. Это в основном биологический процесс, и единственными организмами, способными его осуществлять, являются бактерии. Некоторое количество азота фиксируется при грозовых разрядах, под действием ультрафиолетовых лучей, при работе электрического оборудования и двигателей внутреннего сгорания; однако небиологические процессы такого рода несущественны в количественном отношении, так как все вместе они дают не более 0, 5% всего фиксированного азота. Даже вклад промышленного производства азотных удобрений по методу Хабера составляет лишь около 5%. Таким образом, свыше 90% общей фиксации азота обусловлено метаболической активностью определенных бактерий.

Биологическая фиксация азота в природе осуществляется частично свободноживущими бактериями (несимбиотическая фиксация азота), а частично бактериями, существующими в сообществе с растениями (симбиотическая фиксация азота).

Наиболее важными и изученными микроорганизмами, способными к симбиотической фиксации азота, являются бактерии рода Rhizоbium, внедряющиеся в корневые волоски бобовых растений и развивающиеся в образованных на корнях клубеньках, где и происходит фиксация азота. Ферментативный аппарат для фиксации азота синтезируется бактерией; растение-хозяин обеспечивает условия, благоприятствующие проявлению этого свойства.

К наиболее важным микроорганизмам, осуществляющим несимбиотическую фиксацию азота, относятся цианобактерии, образующие гетероцисты, такие, как Аnabаеnа и Nostoc. К. фиксации азота способен также целый ряд других как аэробных (Azotobacfer, Beijerinckia и Bacillus polymyxa), так и анаэробных бактерий (фотосинтезирующие бактерии и Clostridium spp.).

Определение количества фиксированного азота в расчете на один гектар в год (табл.) показывает, что вклад симбиотических клубеньковых бактерий значительно превышает вклад несимбиотических азотфиксаторов. Однако надо учитывать тот факт, что исследования проводились in vitro. По мнению некоторых авторов, вклад этих бактерий значительно больший, если они обитают в ризосфере растений.

Биологическая фиксация азота стала предметом интенсивного исследования, чему способствовала значимость этого процесса в снабжении растений адекватным количеством азота.

 

Эффективность некоторых азотфиксирующих систем в кг./га за вегетативный период

 

Симбиотические

Люцерна: Rhizobium                              >296

Клевер: Rhizobium                                 247

Люпин: Rhizobium                                 148

Несимбиотические

Цианобактерии                                     25

Azotobacter spp                                     0, 29

Clostrldium pasteurianum                       0, 25

(Из книги Е Н Мишустина и В К Шильниковой (Mishustin E. N., Shilnikovа V. К., Biological Fixation of Atmospheric Nitrogen, London, Macmillan, 1971).

Важной целью этих исследований является выведение новых растений, способных служить хозяевами для азотфиксирующих симбионтов. Современный список таких растений хотя и широк, но не включает ни главные пищевые сельскохозяйственные культуры — пшеницу и рис, ни основные фуражные культуры злаков. Большое внимание сейчас привлекают бактерии, обитающие в ризосфере злаков, названные Azospirillum, которые способны фиксировать N₂.

 

ПРЕВРАЩЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКОГО АЗОТА И ОБРАЗОВАНИЕ АММИАКА

Органические азотистые соединения, синтезируемые водорослями и растениями, служат источниками азота для животных. Сложные азотистые соединения растений в процессе их ассимиляции животными в большей или меньшей степени гидролизуются, однако, азот остается в основном в восстановленной органической форме. Тем не менее, животные в отличие от растений в процессе метаболизма выделяют значительное количество азотистых соединений. Форма, в которой выделяется этот азот, варьирует от одной группы животных к другой. Беспозвоночные выделяют преимущественно аммиак, но у позвоночных наблюдается выделение и органических азотистых продуктов; у пресмыкающихся и птиц основное выделяемое азотсодержащее соединение — это мочевая кислота, а у млекопитающих — мочевина. Выделяемые животными мочевина и мочевая кислота быстро минерализуются особыми группами микроорганизмов с образованием СО₂ и аммиака.

Только часть азота, запасенного в органических соединениях в процессе роста растений, превращается в аммиак в результате обмена веществ у животных, а также при микробном разложении мочевины и мочевой кислоты. Значительное его количество сохраняется в растительных и животных тканях и освобождается лишь после смерти этих организмов. Когда умирает растение или животное, компоненты его тела немедленно подвергаются действию микроорганизмов, и азотистые соединения разрушаются с образованием аммиака. Часть азота ассимилируется самими микроорганизмами и таким образом превращается в компоненты микробной клетки. В конечном счете, и эти компоненты переходят в аммиак после отмирания микробов.

Первый этап этого процесса аммонификации — гидролиз белков и нуклеиновых кислот с освобождением соответственно аминокислот и органических азотистых оснований, более простых соединений, которые затем также расщепляются в результате дыхания и брожения.

Разрушение белка в анаэробных условиях (гниение) обычно не приводит к немедленному освобождению всего аминного азота в виде аммиака. Некоторые аминокислоты превращаются в амины. Гнилостное разложение характерно для деятельности анаэробных спорообразующих бактерий (рода Clostridium). В присутствии воздуха амины окисляются другими бактериями с выделением аммиака.

Водоросли и растения ассимилируют азот в виде нитрата или аммиака. Если ассимилируемой формой является нитрат, то он должен быть восстановлен в клетке до аммиака. Количество восстановленного нитрата соответствует такому количеству азота, которое требуется для роста данного организма; аммиак при этом не выделяется. Именно такая особенность отличает ассимиляцию нитрата растениями (а также микроорганизмами) от восстановления нитрата (нитратредукции) — процесса анаэробного дыхания, существующего только у прокариот (рис. 21).

 

НИТРИФИКАЦИЯ

В процессе всех превращений, которым подвергается азот с момента его ассимиляции растениями до его освобождения в виде аммиака, атом азота остается в восстановленной форме. Превращение аммиака в нитрат (нитрификация) осуществляется в природе двумя высокоспециализированными группами облигатно аэробных хемоавтотрофных бактерий. Нитрификация происходит в два этапа: на первом аммиак окисляется до нитрита, на втором нитрит окисляется до нитрата. В результате совместной деятельности этих бактерий аммиак, освобождающийся в процессе минерализации органического вещества, быстро окисляется в нитрат. Таким образом, нитрат—основное азотистое вещество почвы, используемое растениями в процессе роста. Практика удобрения почвы навозом основана на микробной минерализации органического вещества, которая приводит к превращению органического азота в нитраты путем аммонификации и нитрификации. Еще более простым способом повышения содержания нитратов в почве служит орошение полей разбавленными растворами аммиака, что является одним из современных методов удобрения почв. Аммиак, который можно синтезировать химическим путем из молекулярного азота,—это наиболее концентрированная форма доступного связанного азота, поскольку он содержит около 82% азота по весу. Нитраты представляют собой весьма растворимые соединения, поэтому они легко выщелачиваются из почвы и уносятся водой; следовательно, определенное количество связанного азота постоянно удаляется с континентов и переносится в океаны. В некоторых местностях, особенно в полузасушливых районах Чили, в почве накапливаются отложения нитратов в результате выхода и испарения поверхностных вод.

Такие отложения — ценный источник удобрения, хотя их значение существенно снизилось за последние 50 лет вследствие развития химических методов производства азотистых соединений из атмосферного азота.

 

ДЕНИТРИФИКАЦИЯ

В анаэробных условиях многие аэробные бактерии вместо кислорода могут использовать нитрат в качестве конечного акцептора электронов.

Таким образом, всякий раз, когда при разложении органического вещества в почве или воде кислород исчерпывается в результате дыхания аэробных микроорганизмов, некоторые из этих аэробов в присутствии нитрата продолжают дышать за счет органического вещества, т. е. переходят к анаэробному дыханию. При этом происходит восстановление нитратов. Некоторые бактерии (например, Escherichia coli) способны восстанавливать нитрат только до уровня нитрита, другие (например, Pseudomonas aeruginosa) могут восстановить его до газообразного азота. В ходе этого процесса, называемого денитрификацией, связанный азот удаляется из почвы и воды с освобождением газообразного N₂ в атмосферу.

Денитрификация — процесс, имеющий большое экологическое значение. Он лишает почву необходимого для растений азота, снижая за счет этого продуктивность сельского хозяйства. Особенно значительные потери происходят в удобренных почвах. Хотя точные цифры не известны, но при определенных условиях удобрения могут утрач