Тема 12. Генетика бактерий. Бактериофагия.

Задача № 1.

Какие аспекты изменчивости микроорганизмов наиболее важны с точки зрения а) бактериолога, б) биотехнолога, фармацевта?

Ответ: а) в практике бактериолога - формирование новых вариантов под влиянием различных факторов, в т.ч. химиотерапевтических препаратов, что затрудняет идентификацию возбудителя;

б) в деятельности биотехнолога, фармацевта в настоящее время остро стоит проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов. Большую роль в этом процессе играют подвижные генетические элементы, осуществляющих горизонтальный перенос генов, обеспечивающих устойчивость к антимикробным химиопрепаратам. Из числа мобильных генетических элементов наибольшее значение имеют R-плазмиды. Широкое распространение возбудителей инфекционных заболеваний, несущих R-плазмиды, легкость их передачи и трудности лечения заболеваний, вызванных антибиотикорезистентными возбудителями, делают данную проблему особо актуальной биотехнолога, фармацевта, т.к. определяет необходимость разработки, создания и внедрения в клиническую практику новых антимикробных препаратов.

Автор: Перьянова О.В.

Задача № 2.

При санитарно-бактериологических исследованиях сточных вод поселка «М» периодически обнаруживали дизентерийный бактериофаг.

1. О чем свидетельствуют данные результаты?

2. Каким методом, возможно, определяли наличие дизентерийный бактериофага?

Ответ:

1. Это свидетельствует об эпидемиологическом неблагополучии, вероятно связанном с наличием бактерионосителей и/или больных дизентерией в данном поселке.

2. Определение наличия дизентерийного бактериофага проводится с помощью реакции фаголизиса с тест-культурами возбудителей дизентерии и пробами воды. Обнаружение дизентерийного бактериофага косвенно свидетельствует о наличии возбудителей дизентерией.

Автор: Перьянова О.В.

Задача № 3.

На фармацевтическом предприятии выявлены случаи контаминации лекарственных средств. При проведении санитарно-бактериологического исследования были выделены культуры золотистого стафилококка, имеющие фаготип 3А/3С/55. Из десяти фармацевтических работников, участвующих в изготовлении лекарственных средств обследованных по поводу носительства золотистого стафилококка, из носа были выделены культуры золотистого стафилококка у трех. У обследованного фармацевтического работника «Н» культура имела фаготип 29/3А/80, у «М» – фаготип 3А/3С/55, у «К» - фаготип 29.

1. Кто из обследованных послужил источником контаминации лекарственных средств?

2. Какие меры надо предпринять для прекращения распространения золотистого стафилококка?

Ответ:

1. Источником контаминации лекарственных средств является фармацевтический работник «М», т.к. культуры стафилококков, выделенные от него и лекарственных средств, имеют один фаготип.

2. Мероприятия, которые необходимо провести для прекращения распространения золотистого стафилококка:

- санация бактерионосителей;

- бактерионосителей временно перевести на работу не связанную с риском контаминации лекарственных средств;

- в асептическом блоке провести дезинфекцию;

- соблюдение правил асептики.

Автор: Перьянова О. В.

Задача. № 4 Иллюстрация эксперимента

Схема эксперимента:

а — мышь, которой введена культура патогенного капсулированного штамма S пневмококов, погибает;

б — мышь, которой введена культура непатогенного бескапсульного R—мутанта нормального S—штамма, не погибает;

в — мышь, которой введена культура S—штамма, убитого предварительно нагреванием, не погибает;

Г — мышь, которой введена смесь живой культуры R—мутанта и убитой нагреванием культуры непатогенного S—штамма, погибает; в этом случае присутствие убитых нагреванием S—бактерий вызвало??? живых R—бактерий.

1. Эксперимент какого ученого иллюстрирует приведенная схема?

2. Какой механизм генетической изменчивости открыт в приведенном эксперименте?

3. Какой результат получен в эксперименте с пневмококками?

Ответ:

1. Эксперимент Гриффитса;

2. Трансформация;

3. Восстановление способности к образованию капсулы, как ведущего фактора вирулентности и патогенность.

Автор: Подгрушная Т.С.

 

Задача 5. От 8 пациентов с клиническим диагнозом «Генитальный герпес» был забран патологический материал и проведено ПЦР-исследование – См. фото.

 

М 1 2 3 4 5 6 7 8  К^- К⁺

М – маркер молекулярной массы

                                                                         1-8 – исследуемые образцы

                                                                         К^- контроль заведомо отрицательный

К^{+ -} контроль заведомо положительный

1. Учтите и оцените полученные результаты. 

2. Что являлось маркером возбудителя при проведении ПЦР?

3. Возможно ли получение ложноположительных и ложноотрицательных результатов? Если – да, то почему это возможно и как этого избежать.

Ответ:

1. Результаты достоверны. ПЦР положительная у обследуемых 1-4, т.к. при исследовании данных образцов были выявлены метки на уровне заведомоположительного контроля и обнаруженная ДНК по молекулярной массе соответствовала искомой ДНК вируса герпеса (результат сравнения с маркером молекулярной массы), следовательно генетически можно подтвердить диагноз у данных обследованных; ПЦР отрицательная у обследуемых 5-8, т.к. не выявлено меток, следовательно диагноз не подтвержден.

2. Маркером для ПЦР являлась ДНК вируса простого герпеса.

3. Получение ложноположительных результатов возможно в случае несоблюдения противоэпидемиологического режима в лаборатории и контаминации другими нуклеиновыми кислотами исследуемых образцов, либо использовании одних наконечников при проведении ПЦР. Получение ложноотрицательных результатов возможно в случае неполной очистки при получении ДНК из исследуемого образца вследствие присутствия ингибиторов ПЦР, либо утрате ДНК вследствие присутствия нуклеаз, либо неправильно подобранного праймера.

Автор: Хохлова О.Е.

 

Задача № 6.

Известно, что РНК вируса гриппа А фрагментарна и состоит из 8 сегментов, каждый из которых является моноцистронным геном. Вирион вируса состоит из 7 структурных белков, кроме этого в его составе имеются 3 неструктурных белка, принимающих участие в репликации вируса.

1. Объясните, как может достигаться эффект расширения генетической емкости РНК?

2. Как «дорабатываются» первичные транскрипты с целью приобретения структуры, привычной для мРНК эукариотической клетки?

Ответ:

1. Уникальный механизм – повторная трансляция одной и той же мРНК со сдвигом рамки считывания.

2. Присоединение к 5^/ - концу «шапочки» - cap -метилированных нуклеотидов и полиаденилирование 3^/ - конца.

Автор: Подгрушная Т.С.

 

Задача №7.

Гены «домашнего хозяйства» и продукты их экспрессии, используемые для молекулярной идентификации микроорганизмов.

1. Что такое гены «домашнего хозяйства»?

2. Приведите примеры генов «домашнего хозяйства», какие продукты образуются в результате их экспрессии?

Ответ:

1. Гены «домашнего хозяйства» (housekeeping genes) – это гены, которые экспрессируются на относительно постоянном уровне на всех стадиях жизненного цикла микроорганизма. Они обеспечивают процесс гликолиза, биосинтез аминокислот и нуклеотидов, катаболизм белков и т.п..

2. К числу генов «домашнего хозяйства» относятся:

· гексокина́за (АТФ-зависимая D-гексоза-6-фосфотрансфераза) — цитоплазматический фермент класса трансфераз, подкласса фосфотрансфераз, первый фермент пути гликолиза, осуществляющий фосфорилирование шестиуглеродных сахаров (гексоз) с использованием энергии АТФ.

· Например, бактериальный белок RecA - основной белок системы репарации двухцепочечных разрывов ДНК.

· Например, 7 основных генов S. aureus:

           arc C (carbamate kinase)

           aroE (shikimate dehydrogenase)

           glpF (glycerol kinase)

           gmk (guanilate kinase)

           pta (phosphate acetyltransferase)

           tpiA (triase phosphate isomerase)

           ypiL (acetyl-CoA acetyl-transferase)

Авторы: Перьянова О.В., Хохлова О.Е.

Задача № 8.

В ГКБ поступил пациент с абсцессом правого бедра. В момент поступления был забран патологический материал и проведен бактериологический метод диагностики, выделены – S. aureus и S. epidermidis в количестве 10⁷ КОЕ/г. Через 5 суток пребывания в стационаре из раны был выделен MRSA.

1. В результате чего произошла смена возбудителя?

2. Назовите генотипические методы, позволяющие доказать вашу точку зрения.

3. Что является основой генотипирования с целью выявления источника и путей распространения?

Ответ:

1. Вследствие нахождения в стационаре произошло присоединение внутрибольничной инфекции, вызванной MRSA. Возможными источниками инфекции являлись – бактерионосители MRSA среди медицинского персонала, больные; возможными факторами передачи – руки, медицинский инструментарий, оборудование, предметы ухода и обихода вследствие нарушения санитарно-эпидемического режима.

2. Для генотипирования выделенных штаммов используются методы:

- плазмидный анализ;

- рестрикционный анализ хромосомной ДНК;

- пульс-электрофорез;

- изучение полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-ПЦР);

- риботипирование;

- ПП-ПЦР;

- анализ нуклеотидной последовательности (секвенирование).

3. Основой генотипирования является то, что клонально родственные изоляты имеют определенную характеристику, или признаки, посредством которых они могут быть дифференцированы от неродственных изолятов. Для подтверждения данной точки зрения необходимо установить соответствие выделенных штаммов от больного и штаммов, выделенных от медицинского персонала и с объектов окружающей среды.

Автор: Хохлова О.Е.