Розподіл хворих за характером запалення та розповсюдженості процесу

Характеристика	Асептичний НП (n=170)	Інфікований НП (n=55)	Прогресуючий НП (n=12)
Дрібновогнищевий (n=159)	143 (84,11%)	16 (29,09%)	-
Крупновогнищевий (n=56)	27 (15,88%)	23 (41,18%)	6 (50%)
Субтотальний (n=22)	-	16 (29,09%)	6 (50%)
Обмежений	141 (82,94%)	31 (56,36%)	-
Розповсюджений	29 (17,05%)	24 (43,63%)	12 (100%)

 

Субтотальний та тотальний панкреонекроз виявлений у 22 (8,90%) з масштабом ураження більше ніж 50% тканини ПЗ. У більшості хворих цієї групи процес розвивався стрімко. У 6 хворих цієї групи була блискавична форма НП. Переважав геморагічний тип панкреонекрозу, що розповсюджу-вався за межі ПЗ на органи заочеревинного простору та черевної порожнини. Об’єм та характер враження органів заочеревинного простору визначав різну тактику хірургічного втручання, вибір дренуючих операцій, тактику повторних втручань.

Хворі на некротичний панкреатит, що знаходилися на лікуванні в клініці протягом 2001–2007 рр., у яких застосовувалася вдосконалена лікувальна тактика, склали основну групу. У дослідження включено 247 з НП хворих (чоловіків – 164, жінок – 83, середній вік хворих склав 44,6 років). У основній групі виділено 2 підгрупи. І група – 170 хворих на асептичний панкреонекроз (чоловіків - 119, жінок - 51, вік - від 21 до 78, середній вік 44,4 ); ІІ група – 77 хворих на інфікований панкреонекроз (чоловіків - 45, жінок - 32, вік - від 17 до 65, середній вік - 41,8); ІІІ група (контроль) - 108 хворих на некротичний панкреатит, що лікувалися з 1999-2001 (ретроспективний аналіз). Чоловіків - 73, жінок - 35, вік від 25 до 65, середній вік - 42,2 роки. Таким чином, групи були репрезентативні за статевовіковим складом та клініко-морфологічною формою панкреатиту.

З метою дослідження діагностичних та лікувальних патогенетичних особливостей НП з хворих, які знаходилися в клініці протягом 2002–2007 рр., були сформовані окремі репрезентативні групи в залежності від мети та завдань дослідження.

Діагностична програма у хворих на ГП, крім загальноклінічних аналізів крові та сечі, включала біохімічні (білірубін та його фракції, АЛТ, АСТ, сечовина, залишковий азот, креатинін, білок та білкові фракції, електроліти), коагулограму, імунологічні,та бактеріологічні дослідження. У динаміці обстеження хворих проводили оцінку важкості стану ГП по шкалі Ranson (1974) і APACHE II (1985). Рівень пептидів середньої молекулярної маси (ПСММ) визначали скринінговим методом, запропонованим Н.І.Габріеляном та співавт. (1981). Дослідження проводились на спектрофотометрі СФ-24 при довжині хвилі 254 нм. Лейкоцитарний індекс інтоксикації вираховували за Я.Я.Кальф-Каліфом (1941).

Імунний статус вивчали по кількісному визначенню різних популяцій лімфоцитів CD3, CD4, CD8, CD4/CD8, CD16, CD20. Вивчали концентрацію в сироватці крові TNFa, IL–1b, IL–8, IL–1Ra, IL–1Ra/TNFa, концентрацію циркулюючих імунних комплексів (ЦИК), IgA, Ig М, IgG методом проточної лазерної цитофлуорометрії (PARTEC). Стан функціональної активності гранулоцитів вивчали по спонтанному та стимульованому HCT-тестам в реакції відновлення нітросинього тетразолію.

В окремих сформованих групах хворих визначали показники мікроелементного гомеостазу (малоновий діальдегід (МДА) плазми крові за модифікованим методом Стальної І.Д (1998), каталазу (КТЛ) еритроцитів за методом Королюка М.А. (1986), С-реактивний білок (якісний аналіз). Стан білкового обміну оцінювали за рівнем білкових фракцій сироватки крові.

Визначення концентрації прокальцитоніну (PCT) проводилося з використання реактивів LUMItest® PCT та PCT-Q-тесту (B·R·A·Н·M·S Diagnostica GmbH, Berlin, Germany). Рівні люмінесценції вимірювали на напівавтоматичному хемілюмінесцентному аналізаторі Magic® Lite II фірми Ciba Corning (Великобританія).

Комплекс бактеріологічних досліджень включав мікробіологічне вивчення вмісту черевної порожнини, пунктату в динаміці та бактеріологічні аналізи на гемокультуру. Якісний склад мікроорганізмів визначали класичною методикою посіву на кров’яний агар з послідуючою інкубацією у термостаті при температурі 37^°С протягом 20 годин. При виявленні в добовій культурі мікробних асоціацій проводили ідентифікацію всіх колоній, що виросли з домінуючої флори.

Чутливість мікрофлори до антибіотиків визначали експрес-методом М.Ф.Камаєва і В.П.Ващука (1975). Відповідь отримували через 4 години. Достовірність експрес-методу контролювали стандартним способом (відповідь через 24-48 годин).

Для виконання лапароскопії використовували набір інструментів фірми “Карл Шторц” (Німеччина). Для гастродуоденоскопії, ретроградної холангіографії і ендоскопічної папілотомії – фіброволоконний відеоендоскоп Fujinon EVE W-88A. Ендоскопічне дослідження шлунку, дванадцятипалої кишки виконували за допомогою фіброгастро- та фібродуоденоскопів фірми Olympus GIF-P3 та GIFQ10. Для комп'ютерної томографії (КТ) використовувався апарат ELSCINT select SP (CT 9401) з рентгенівською спіральною трубкою 360 за 1,8 с із товщиною зрізу 1 см, ікретент 7 мм. Для ультразвукового дослідження (УЗД) ми використовували УЗ апарат SHIHADZU SDV – 2000, що працює в режимі реального часу та оснащений конвексним, секторним та лінійним датчиками з робочою частотою сканування 3,5-7,5 МГц.

Інтенсивна терапія була стандартизована у відповідності із визначеним лікувально-діагностичним алгоритмом (раціональна антибіотикопрофілактика, корекція кислотно-основного та водно-електролітного обміну, дезінтокси-каційна терапія, інгібітори протеолітичних ферментів, антисекреторна, знеболююча, антиоксидантна, антицитокінова, імуномодулююча терапія, метаболічне забезпечення, екстракорпоральна детоксикація).

Імунокорекцію здійснювали шляхом використання рекобінантного IL-2 "Ронколейкін ®" 0,5 мг (при масі тіла <70 кг) чи 1,0 мг (при масі >70 кг) розчиняли у 200 мл фізіологічного розчину, в який попередньо додавали 10 мл 10% альбуміну. Препарат вводиться внутрішньовенно крапельно повільно (15 крапель на хв.) в 1 добу від початку захворювання з інтервалом 48 год. (від 3 до 9 введень). Доза та кратність введення визначаються типом імунної відповіді: синдромом системної запальної відповіді (ССЗВ) чи імунодепресією. Число інфузій від 3 до 9 через кожні 48 годин до вираженого клінічного ефекту та нормалізації абсолютного числа лімфоцитів та їх субпопуляцій (СD3, CD4, CD8).

Для корекції інтоксикаційного синдрому ізольовано і поєднано використовувалися засоби і методи інтра- і екстракорпоральної детоксикації. Як методи інтракорпоральної детоксикації застосовувалися: 1) інфузійна терапія (внутрішньовенна) дезінтоксикаційних засобів (сорбілакт, реосорбілакт, рефортан, стабізол), а також метод гемодилюції з наступним форсованим діурезом; 2) інтестинальний діаліз (фізіологічний розчин по 500 мл 2-3 рази на добу); 3) ентеросорбція (50 г ентеросгелю чи 30 г поліфепана на 300 мл фізіологічного розчину 2-3 рази на добу).

З метою екстракорпоральної детоксикації використовували обмінний плазмаферез (ПФ). Його здійснювали з використанням центрифуги РС-6 і полімерних контейнерів “Гемакон 500/300”. В середньому цей метод починали проводити через 2,46±1,3 доби після поступлення пацієнта в відділення інтенсивної терапії. Заміщення плазми здійснювали шляхом інфузії поліелектролітних розчинів, розчинів синтетичних амінокислот, реополіглю-кіну, 5-10% розчинів альбуміну. Перед початком сеансу ПФ здійснювали інфузію лікарських препаратів в черевний стовбур за допомогою інфузомату. До складу інфузату включали антиферментні препарати (50-100 тис. ОД за контрикалом) з метою утворення неактивних комплексів з протеазами та цитокінами для подальшого їх виведення під час ексфузії. Для відновлення органного кровообігу ("розкриття вогнища") використовували внутрішньо-артеріальну інфузію реологічно активних засобів (рефортан, реополіглюкін). Одноразово заміщали в середньому 550±65 мл плазми. Сеанси проводили через день, курс лікування - 3-6 сеансів у залежності від ступеня прояву інтоксикації і динаміки клініко-лабораторних показників.

Статистичне опрацювання показників проводили за допомогою стандартних комп'ютерних програм (Statistica 6.0 for Windows).

Основні результати досліджень. Для з'ясування механізмів загибелі панкреацитів при ГЕП ми використали поєднання морфологічного дослідження з аналізом хроматину, що дозволяє диференціювати характер деструктивних процесів в клітині на ранніх етапах патологічного процесу.

Через 2-2,5 години від початку ініціації гострого панкреатиту у всіх піддослідних тварин був виражений міжклітинний набряк ПЗ, міжацинарний простір розширений. Серед ацинусів з нормальною будовою визначалися групи клітин з деструктивними змінами різного типу. Найхарактернішою була ознака втрати еозинофілії та базальної базофілії цитоплазми, ущільнення ядра, розширення перинуклеарного простору, полярність клітини порушення, ядро займало центральне положення. Межі клітини були нечіткі та розмиті. Кількість гранул як в набрякових так і в пікнотичних панкреоцитах була різко зменшена. Хроматин сконденсований у вигляді великих брилок біля оболонки ядра та зміщений до його полюсів у вигляді на півмісяця. Ці зміни є раннім проявом апоптозу, що передує процесу деградації. Ця стадія розвитку клітинної загибелі визначалася як преапоптоз.

Визначався розпад ядра на фрагменти – типові апоптозні тільця. Ознаки некрозу визначені лише у 11,11% випадків експериментального ГП: різке набухання ядра, хроматин подібний на пластівці, набряк та вакуолізація цитоплазми, розриви ядерної та плазматичної мембран.

При забарвленні за методом TUNEL на зрізах тканини виявлялися множинні ядра, що дають позитивну реакцію на фрагменти ДНК, при цьому найінтенсивніша реакція характерна для зони щільних ядер. Це один з основних проявів апоптозу на біохімічному рівні, який реалізується в ядрі клітини і складається з фрагментації ДНК. Вже на цій стадії реєструвалася конденсація хроматину та вип’ячування ядерної мембрани, що характерні для апоптозу. Саме цей початковий етап фрагментації хоматину був ключовим моментом апоптозу, після якого процес був незворотнім..

Через 5 години від початку ініціації ГП у більшості тварин визначалися групи слабко забарвлених без'ядерних клітин та їх фрагменти, між якими розкидані окремі кулькоподібні накопичення конденсованого хроматину. В двох тварин визначенні крововиливи та невеличкі фокуси некрозу ацинарних клітин. У всіх піддослідних тварин незалежно від ступеню пошкодження в зонах деструкції ацинусів спостерігалися нейтрофільні лейкоцити, велика кількість ядер, які дають позитивну реакцію на фрагменти ДНК. Визначені нами зміни ядер: конденсація хроматину біля нуклеолеми та зміщення його до полюсів ядер з утворенням півмісяців, деформація та розпад ядра на кульоподібні фрагменти були ознаками апоптозу. Прямим підтвердженням загибелі панкреоцитів шляхом апопотозу у даному експерименті став позитивний тест на міжнуклеосомні розриви ДНК, які виявлені при забарвленні за методом TUNEL.

Проведені дослідження показали, що на початкових етапах розвитку гострого панкреатиту в наведеній експериментальній моделі загибель клітин підшлункової залози проходить переважно шляхом апоптозу.

Оскільки протягом перших двох годин проведеного експерименту лейкоцити в зонах деструкції ацинусів були відсутні, відповідно загибель клітин ацинусів запускається автономно агентами, що утворюються в самих панкреоцитах, в першу чергу – TNFб.

Проведені експериментальні морфологічні дослідження показали, що на ранніх етапах розвитку ГЕП істотно зростала активність макрофагіву у всіх досліджуваних групах тварин. Але найбільш виражені ультраструктурні зміни макрофагів і найбільш виражена їх активація спостерігалася через 5 год. після індукції ГЕП. У цитоплазмі виявлялися у великій кількості рибосоми, гіпертрофований пластинчастий комплекс Гольджи, набряклі мітохондрії і розширені цистерни гранулярної ендоплазматичної мережі, у матриксі з'являються численні крісти.

Оцінка імунних показників, яку провели у групах тварин показала, що в першій групі відбувалося повне зниження показників клітинної ланки імунітету. У 100 % відбувалися однонаправлені порушення. При цьому найбільше страждала ланка в Т-клітинному ланцюзі. Була виявлена лімфопенія, достовірне зниження абсолютного та відносного вмісту Т-лімфоцитів в CD3 (49,1±2,2%), пригнічення проліферативної відповіді Т - клітин при їх стимуляції. В цілому рівень активаційної проліферації Т-клітин був в 2 рази знижений у порівнянні з контрольною групою (72±7%).

У поєднанні із анергією Т-клітин це було прямим підтвердженням домінування механізмів загальної імунодепресії у патогенезі ГП. Додатково зареєстровано підсилення апоптозу лімфоцитів та збільшення долі NK-клітин (CD16) -16,1±1,1% (р<0,05). Важливим механізмом формування загальної депресії була індукція. У той же час, у ІІ серії дослідів тварин спостерігався коригуючий вплив на імунну систему, Підсилювалася проліферативна активність Т-клітин у відповідь на мітогени. Суттєво знижувався рівень апоптозу лімфоцитів. Причому у однієї тварини до нормальних значень.

Вірогідно, обмеження апоптозу лімфоцитів є однією із причин збільшення їх абсолютного та відносної кількості у крові, на фоні імуноорієнтованої терапії.

У ІІІ досліджуваній серії призначення препарату по заданій схемі призвело до підсилення загальної кількості Т-та В-лімфоцитів, а також фракції CD4 (18,3±3,1 до 31,1±2,1,%) (р<0,05)., CD8 (20,6±3,5 - 30,3±3,4%) (р<0,05). Збільшувалася також функціональна активність клітинних складових імунореактивності. Виявлене зменшення дисбалансу цитокінової регуляції (0,8±0,1-1,5±0,1,%) (р<0,05). Імунокоригуючий ефект, що проявлявся збільшенням в системній циркуляції загальної кількості лімфоцитів, а також CD3, CD4 – лімфоїдних клітин, відновленням у мононуклеарів здатності до проліферації, зменшенням апоптозу лімфоцитів на фоні терапії спостерігався у 62% тварин. Необхідно відмітити, що біля третини ніяк не відповідали на цитокінотерапію. І якраз серед них летальність склала 100%.

Таким чином, у тварин які адекватно відповіли на проведену імунотерапію летальність склала 5%, серед тварин у яких не було ніякої динаміки летальність склала – 50%, і у серед тварин де подальше поглиблювалася імунодепресія летальність склала 100%.

Імуноорієнтована терапія у експерименті позитивно впливала на експресію лімфоцитарних диференційних антигенів CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, хоча зміни їх функціональної активності не носили однонаправленого характеру. При цьому чітко прослідковувалася тенденція лише до підсилення проліферативних процесів

При вивченні клінічних результатів визначено, що порівняльні результати променевих методів діагностики у первинній діагностиці та стратифікації НП виявили високу ефективність УЗД 80,4% (р<0,05). у ранній діагностиці ГП та його ускладнень, таких як ферментативний перитоніт, ексудативний плеврит. У той же час, відзначалася низька ефективність цього методу у діагностиці тяжкого НП, яка склала всього 57,9% (р<0,05). Разом з тим, при верифікації біліарного панкреатиту, ефективність УЗД склала 86,5% (р<0,05). Зовсім неефективним УЗД було у діагностиці гнійних ускладнень НП – 17,1% (р<0,05), проти 79,6% (р<0,05) у діагностиці асептичного НП.

При аналізі результатів КТ виявлено, що КТ-діагностика з використанням контрастного підсилення виявилася ефективною у 96,94% (р<0,05) спостережень. У той же час, при скануванні в стандартному режимі ефективність склала лише 81,82% (р<0,05). При оцінці об'єму некрозу ПЗ у ранні терміни захворювання ефективність склала 93,32% (р<0,05). Використання КТ із внутрішньовенним контрастним підсиленням ультравістом дозволило поліпшити візуалізацію паренхіми залози на фоні ексудату у перипанкреатичній зоні та оцінити її розміри, межі зон ексудації.

Аналіз діагностичної цінності КТ моніторингу НП показав його високу точність 93,28% (р<0,05). та специфічність 92,43% (р<0,05). в оцінці об'єму некрозу заочеревинної клітковини. І лише 48,61% (р<0,05). ефективності цього методу при верифікації інфікованого некротичного панкреатиту.

Для диференціації асептичного та інфікованого процесу ми досліджували зміни концентрації прокальцитоніну (РСТ). При цьому були виявлені значні коливання концентрації РСТ при інфікованому НП. Середній рівень РСТ у тяжких хворих був значно вищим, ніж при асептичному панкреонекрозі.

За нашими даними максимальні рівні РСТ при інфікованому панкреонекрозі спостерігалися до оперативного втручання 3,63±1,19 нг/мл; (р<0,001) та в перші 4-5 діб післяопераційного періоду 2,87±0,64 нг/мл; (р<0,001). Нормалізація показників проходила на 12-14 добу, за умови розрішення інфекційного процесу. Середні значення рівня РСТ склали 0,83±0,78 у І групі та 2,88±0,33 у групі з інфекційним НП. При цьому отримані значення статистично відрізнялися (p<0,001).

Чутливість та специфічність PCT із діагностичним порогом більше 10 нг/мл для діагностики інфікування ПН склали 88 % та 94 % відповідно. У випадку, коли за діагностичний поріг встановили ³ 2 нг/мл, чутливість, специфічність прогностичне значення PCT були 100 % та 88 % відповідно. З діагностичним порогом ³ 0,5 нг/мл чутливість, специфічність були 100 % та 35 % відповідно.

При дослідженні показника клітинного апоптозу визначено, що він був низький в обох групах, але в І групі показник CD95 достовірно зростав (р‹0,05), тоді як в ІІ групі він достовірно знижувався (р‹0,05).

За даними нашого дослідження апоптоз, що індукувався через систему Fas-рецептор – FasL попереджувався додаванням екзогенного ІL-2. В його розвитку мав місце дисбаланс активаційних сигналів, що було пов'язано із дефіцитом ІL-2. Наш клінічний досвід показав, що при використанні в комплексній терапії хворих на НП синтетичного ІL-2 відбувалось зниження процесу програмованої загибелі імунокомпетентних клітин. Враховуючи системну дію ІL-2 ми передбачаємо, що процес апоптотичного захисту повинен розповсюджуватися і на тканини ПЗ.

У хворих із важким перебігом НП при відсутності інфікування некротичних вогнищ констатовано поступове протягом першого тижня захворювання зниження вмісту прозапальних цитокінів, насамперед ІL-1в і TNF-б, з наближенням їх до показників контрольної групи. Зниження їх вмісту супроводжувалося поступовим покращанням стану хворого: зменшувалася частота серцевих скорочень і дихання, знижувалася температура тіла, нормалізувалися показники загального аналізу крові (зменшувався лейкоцитоз, зростала кількість лімфоцитів і моноцитів, з'являлися еозинофіли).

По тяжкості вихідного стану хворі були розподілені на три групи: І група (32 пацієнти) – 8-12 балів, ІІ група (30 пацієнтів) -12-16 балів, ІІІ група (29 пацієнтів) -16 балів і вище. Тяжкість стану хворих за шкалою АРАСНЕ–ІІ відповідала 8 балам і вище.

Аналіз кількісного вмісту медіаторів запальної відповіді у хворих, в яких у подальшому розвинулось інфікування вогнищ некрозу або парапанкреатичних скупчень рідини, вихідні рівні ІL-1в, ІL-1R б, IL-8, TNF-б були дещо вищими від середніх показників хворих із асептичними некрозами. Цю тенденцію спостерігали протягом першого тижня захворювання. Починаючи із 7 доби, у хворих з інфікованим некрозам відмічено значне зростання концентрації IL-8 (р<0,05) з одночасним зниженням рівнів інших прозапальних цитокінів.

У пацієнтів з НП із летальним кінцем вже у перший день захворювання зафіксовано найвищі рівні всіх прозапальних цитокінів. Дослідження показало, що при значеннях TNF-б понад 21,0 пг/мл летальність серед хворих сягала майже 100%.

На ранніх стадіях НП, майже одночасно з медіаторами запальної відповіді, починався синтез біологічно активних речовин із протизапальними властивостями. Збільшувався продукція природних антагоністів прозапальних цитокінів – ІL-1Rа. Особливо помітним було зростання концентрації ІL-1Rа, яке перевищувало показники контрольної групи (220,37±57,59 пг/мл) в 5,1 разів у хворих із легким перебігом НП (1118,6±254,2 пг/мл, р < 0,001) і 12,3 рази при важкому перебігу захворювання (2782,8±270,34 пг/мл, р < 0,05), не зростав у хворих із інфікованою формою НП (табл. 2).

 

Таблиця 2