Мазки из носа, зева и смывы из ротоглотки

 Образцы используют для выявления многих респираторных вирусов. Мазки из зева исследуют на наличие Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella  spp. методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

СЫВОРОТКА КРОВИ

 Образцы сыворотки крови изучают с помощью серологических методов в острый период инфекции и у реконвалесцентов для диагностики пневмоний, вызванных Legionella pneumophila, C hamydia pneumoniae, Chlam ydia psittaci, M ycoplasma pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, вирусами и грибами.

 

 type: dkli00087

ПРЯМЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ОБРАЗЦОВ

МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ

 Микроскопический метод изучения нативных и окрашенных препаратов, в том числе с использованием меченных флюорохромом специфических антисывороток (антительные диагностикумы), обеспечивает быструю предварительную или окончательную диагностику ИНДП и позволяет судить об адекватности материала (в первую очередь мокроты).

 При исследовании мокроты начальный этап - отбор гнойных или опалесцирующих участков и перенос их в стерильную чашку Петри. Интересующая часть образца используется для приготовления влажного или окрашенного по Граму мазка для микроскопии. Дифференциацию слущенных эпителиальных клеток (СЭК), реснитчатых эпителиальных клеток, альвеолярных макрофагов и гистиоцитов проводят под малым увеличением микроскопа (объектив x10). Присутствие большого числа СЭК (>25 в поле зрения) свидетельствует о контаминации микрофлорой ротоглотки. Такой образец не пригоден для посева, и материал следует взять повторно. Преобладание в образце полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ), клеток реснитчатого эпителия или альвеолярных макрофагов при отсутствии или незначительном числе СЭК (<10 в поле зрения) свидетельствует о наличии секрета из нижних отделов дыхательного тракта, который подлежит дальнейшему исследованию с помощью иммерсионного объектива при увеличении в 1000 раз и посеву. Диагностический критерий качества мокроты - наличие не менее 25 ПЯЛ и менее 10 СЭК при исследовании в 10 полях зрения под малым увеличением микроскопа (объектив x10). Цитологическая оценка пригодности мокроты важна для бактериального исследования, но не для культуральной индикации МБТ, грибов и вирусов, где перед культивированием производится деконтаминация образцов, используются селективные среды, а обнаружение МБТ, патогенных грибов или вирусных изолятов не вызывает сомнения в их клинической значимости [2].

 Под большим увеличением (иммерсионный объектив x100) изучают морфологию бактерий. Чувствительность микроскопического метода при окраске по Граму по разным оценкам варьирует от 35 до 96%, а специфичность - от 12 до 85% [17]. Его диагностическое значение, в основном, ограничивается пневмококковой инфекцией, где совпадение с результатами культуральной диагностики составляет 75% [18].

 Эффективность метода для выявления других патогенов у взрослых проблематична. Например, Haemophilus influenzae можно обнаружить в ВДП у здоровых индивидуумов, но гемокультура, как дополнительный диагностический критерий в пользу микроскопического исследования, выделяется редко. Определение в моче антигенов H. influenzae типа В имеет значение в педиатрической практике, но антигенурия может быть следствием вакцинации. У взрослых лишь получение БС инвазивными методами помогает в установлении диагноза. При пневмониях, вызванных H. influenzae, высокую диагностическую ценность имеет исследование ТТА и БАС [19]. Присутствие в образцах большого числа плеоморфных тонких коккобацилл, часто внутри ПЯЛ, достоверно свидетельствует в пользу пневмонии, обусловленной гемофильной палочкой.

 Среди других возможных возбудителей ИНДП Moraxella catarrhalis - комменсал ВДП, а носительство Neisseria meningitidis в ротоглотке может варьировать от 10% у взрослого населения до 70% у военнослужащих в закрытых воинских коллективах. Обнаружение в мокроте или ТТА большого числа грамотрицательных диплококков, локализованных внутри и вне ПЯЛ, с высокой вероятностью свидетельствует о возможном участии в этиологии пневмонии морфологически сходных между собой M. catarrhalis или Neisseria spp. [20], что позволяет определить направление дальнейшего культурального исследования.

 Проблемы при дифференциации между колонизацией и суперинфекцией возникают с бактериями кишечной группы и псевдомонадами. Обычно грамотрицательные палочки, вызывающие вторичную инфекцию, определяются в значительном числе в мазках мокроты и в ТТА наряду с ПЯЛ, достигая при посеве концентраций 10⁷ - 10¹⁰ КОЕ/мл. Однако и у пациентов ОИТ, находящихся на ИВЛ, в дыхательном секрете можно обнаружить до 10⁸ КОЕ/мл без признаков пневмонии [23].

 Таким образом, окраска мазков по Граму - важный и необходимый этап исследования мокроты для определения ее пригодности к культуральному исследованию и позволяет быстро обнаружить вероятные бактериальные возбудители пневмонии. Неправильное приготовление мазков и неграмотная интерпретация результатов окраски существенно снижает ценность метода. Изучение ТТА отличается более высокой специфичностью и чувствительностью при индикации микроорганизмов, включая возбудителей анаэробной инфекции.

 Для выявления Mycobacterium tuberculosis микроскопические методы при окраске мазков по Цилю - Нильсену и флюоресцентным красителем имеют одинаковую чувствительность (до 50%) и специфичность (до 99%) [24], совпадение результатов микроскопической и культуральной диагностики зависит от тяжести заболевания. Для обнаружения МБТ в световом микроскопе при окраске по Циль - Нильсену необходимо содержание в мокроте не менее 5000 - 10 000 КОЕ/мл. При окраске мазка аурамин-родамином микроскопия становится более продуктивной в рутинных исследованиях, так как за равный промежуток времени в люминесцентном микроскопе при малом увеличении (объектив x25) можно просмотреть больше полей зрения, чем в световом микроскопе под иммерсией (объектив x90).

 При диагностике актиномикоза легких материалом для микроскопического исследования служат гной, мокрота, плевральная жидкость, пунктаты закрытых очагов поражения, биопсийный материал. Наиболее подходящие для исследования - твердые зернистые образования, из которых сначала готовят неокрашенные препараты в капле 10% щелочи или смеси спирта с глицерином, затем мазки, окрашенные по Граму и Цилю - Нильсену. Уже при малом увеличении микроскопа видны комочки (друзы) с плотным, темным центром, с лучистыми образованиями по периферии, которые в дальнейшем изучают под большим увеличением микроскопа. Обнаружение друз, мицелия, отдельных веточек и цепочек из спор - ценное подтверждение актиномикотической природы болезни.

 

 Прямая фазово-контрастная микроскопия бронхиального секрета, со смесью 10% раствора калия гидроксида и 10% глицерина, позволяет проводить быструю идентификацию грибов Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans и Aspergillus spp., добавление специальных красителей позволяет улучшить очертания элементов гриба, включая P. jiroveci.

 Для обнаружения L egionella pneumophila непосредственно в мокроте, ТТА, БС, биоптатах ткани легкого применяется реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФ), чувствительность которой составляет 25 - 66%, специфичность достигает 94% [25]. Для постановки диагноза легионеллезной пневмонии положительный результат РИФ требуется подтвердить любым другим методом: культуральным исследованием респираторных образцов, либо определением антигена в моче, либо серологическими реакциями с сывороткой крови больного.

 Для определения антигенов P. jiroveci в индуцированной мокроте и БАС можно использовать РИФ с моноклональными антителами. Преимущество метода - высокая чувствительность (90 - 97%) и быстрое получение результатов, недостатком - техническая сложность исполнения [26].

 РИФ позволяет диагностировать инфекции, вызванные респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ), вирусами гриппа А и В, парагриппа, аденовирусами, вирусом кори, что особенно важно в случаях, когда обычная вирусологическая технология трудоемка или недоступна.

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ

 Определение антигенов широко используется для диагностики различных инфекций, что связано с возможностью быстрого получения результатов и идентификации некультивируемых возбудителей. Однако применительно к ИНДП эти методы имеют ряд существенных ограничений. Во-первых, их чувствительность и специфичность, слишком низкие для рутинного использования. Во-вторых, надежность теста в большей степени зависит от того, может ли возбудитель быть комменсалом (как в случае с Streptococcus pneumoniae) или его наличие всегда свидетельствует об инфекции (например, L egionella pneumophila). В-третьих, данные тесты - достаточно дорогие и требуют существенных временных затрат по сравнению с классическими методами [27, 28].

 Для индикации антигенов Streptococcus pneumoniae в мокроте, сыворотке крови и моче были разработаны методы встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ), ко-агглютинации, латекс-агглютинации, иммуноферментного анализа (ИФА). Их чувствительность варьировала от 40 до 90% [29, 30]. Высокая стоимость наборов на выявление пневмококковых антигенов в мокроте и отсутствие исследований, доказывающих влияние антигенов на исход терапии у пациентов, существенно ограничивают возможность их рутинного использования для диагностики пневмоний. Лишь иммунохроматографический тест для выявления пневмококкового антигена в моче в течение 15 мин рекомендован в качестве дополнительного метода диагностики пневмококковой пневмонии, чувствительность которого составляет 86% и специфичность - 94%. Следует помнить о возможности ложноположительных результатов в популяциях с высоким уровнем назофарингеального носительства пневмококков (организованные детские коллективы).

 При гемофильной инфекции методы выявления антигена разработаны только для H. influenzae типа B редко вызывающей пневмонии у взрослых, поэтому в рутинной практике они не используются.

 При диагностике легионеллезной пневмонии рекомендованы ИФА и радиоиммунологический метод для выявления в моче антигенов L. pneumophila серогруппы 1, на долю которой приходится 70 - 90% всех наблюдений болезни легионеров. Их чувствительность достигает 80 - 99 и 99%, специфичность - 99 и 100%, соответственно [31]. Разработан иммунохроматографический тест для определения легионеллезного антигена в моче.

 Существуют наборы для выявления антигенов C. pneumoniae в респираторных образцах, но ввиду перекрестного реагирования с антигенами C. psittaci, они не могут быть рекомендованы к рутинному использованию.

 При криптококкозе определяют наличие антигена C ryptococcus neoformans в БАС, плевральном экссудате, сыворотке крови и ликворе [32], а при аспергиллезе используют ИФА для выявления в сыворотке крови белкового антигена (галактоманнана), превалирующего в клеточной стенке Aspergillus spp. [33]. При легочном бластомикозе в сыворотке крови, моче и БАС можно выявить антиген Blastomyces dermatidis у 70 - 100% больных в зависимости от формы инфекции (локализованная или генерализованная) [34].

 В назофарингеальном аспирате, лаважной жидкости и мокроте в инфицированных эпителиальных клетках с помощью РИФ и ИФА можно быстро обнаружить антигены вирусов гриппа, парагриппа, аденовирусов, ЦМВ в ранние сроки заболевания.

 

 type: dkli00088

КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА