Тема VI. Культура гаплоїдних клітин.

Робота 1. ОТРИМАННЯ КАЛУСІВ З ПИЛЬНИКІВ ВИШНІ

І ЯБЛУНІ.

 

Теоретичні відомості

Гаплоїдія є таким зменшенням числа хромосом, при якому в половинному наборі соматичної і статевої клітин кожна пара гомологічних хромосом представлена лише по одній з них. Гаплоїдом або моноплоїдом називають організм, що має в соматичних клітинах гаплоїдний набір негомологічних хромосом. Генотип гаплоїдів має характерні особливості. У гаплоїдів проявляються рецесивні гени. Гаплоїди на вигляд схожі з відповідними диплоїдами, але менше їх. Клітини гаплоїдів мають менший розмір, ніж клітини диплоїдів. Гаплоїди не утворюють повноцінних гамет. Шляхом подвоєння числа хромосом соматичних клітин гаплоїду можна отримати повністю гомозиготну диплоїдну рослину.

Гаплоїди отримують, використовуючи гаплопродюсерів (віддалену гібридизацію), партеногенез. Гаплоїди можна отримати в культурі тканин з пильників і клітин зародкового мішка, гаплоїди в культурі тканин вже отримані у 200 видів рослин.

Для більшості рослин оптимальним терміном посадки пильників на поживні середовища є стадія "середніх" або "пізніх" одноядерних вакуолізованих мікроспор. На цій стадії мікроспори вивільняються з тетрад і готуються до першого мітозу.

Для культивування пильників використовують середовища: Мурасіге-Скуга з 1/2 концентрацією солей, китайські середовища, середовища з картопляним екстрактом, середовище Ніч. Ауксини або взагалі не додають, або використовують 2,4-Д. З цитокінінів застосовують кінетин і 6-БАП. Агар-агар ретельно промивають, оскільки він містить речовини, що несприятливо впливають на розвиток пильників. Для адсорбції метаболітів, що інгібірують процеси росту в культурі тканин в поживні середовища додають активоване вугілля.

Перед культивуванням пильники витримують при температурі 4-6^о С протягом 2-8 діб. Ізольовані пильники культивують або в темряві, або при слабкому освітленні при температурі 25 + 2^о С.

На поживних середовищах мікроспора може утворити калус або гаплоїдний зародок (спочатку утворюється 40-50-клітинний проембріон). Зародок в глобулярній стадії розриває екзину і проходить стадії, аналогічні розвитку зиготного зародка. Пилок ділиться, клітини збільшуються, екзина розривається і утворюється калус, на якому, змінюючи співвідношення фітогормонів, можна отримати гаплоїдні ембріоїди. Отримання гаплоїдів біотехнологічними методами дозволяє швидко створювати гомозиготні лінії, що робить цю технологію дуже цінною для селекції і генетики.

В процесі культивування ізольованих пильників на поживних середовищах розвиток йде двома шляхами: або прямим андрогенезом (утворенням ембріоїдів і гаплоїдних рослин-регенерантів), або непрямим андрогенезом, коли репродуктивні клітини дедиференціюються і переходять до проліферації, утворюючи спочатку калус, а потім при пасивуванні на спеціальні середовища - морфогенный калус і регенеранти.

 

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, бутони вишні і яблуні, пробірки з середовищем для калусогенезу, препарувальні голки, пінцети, флакон з 96 % спиртом, 6 % розчин хлораміну, вата, фольга.

 

Хід роботи.

1. Бутони стерилізують в 6 % розчині хлораміну 10 хвилин, для цього поміщають бутони в марлевий мішечок по 20 штук в кожний і опускають в склянку із стерилізуючим розчином, потім ретельно промивають бутони (5-6 разів) стерильною дистильованою водою.

2. Переносять бутони на стерильну поверхню столу ламінар-бокса, обережно відокремлюють пилкові мішки від тичинкових ниток.

3. Стерильною препарувальною голкою переносять пильники на поверхню поживного середовища в пробірки по 5-10 пильників в кожну.

4. Закривають пробірки і переносять в термостат з температурою 26^оС і вологістю 70 %.

5. Результати роботи замальовують через 2-4 тижні.

 

Робота 2. ОТРИМАННЯ РОСЛИН-РЕГЕНЕРАНТІВ З ПИЛКОВИХ КАЛУСІВ ВИШНІ.

Теоретичні відомості

Здатність калусів до морфогенезу визначається балансом фітогормонів як в поживних середовищах, так і в самих клітинах (ендогенні фітогормони). Для отримання рослин-регенерантів використовують середовища, які містять кінетин - 0,1-0,3 мг/л, ГК - 4 мг/л, 6-БАП - 0,5-1,5 мг/л, ІОК - 0,5-1,5 мг/л. Калуси культивують при 16 годинному фотоперіоді і інтенсивністю освітлення 2-3 кLх.

Морфогений калус має щільну консистенцію, горбисту поверхню, молочно-білий, жовтуватий і зеленуватий колір.

Поверхневі шари морфогенного калусу складаються з меристематичних, багатих цитоплазмою клітин, що мають заповнені крохмалем пластиди і добре розвинені мітохондрії. Центральна частина калусу представлена великими вакуолізованими клітинами з пікнотичними ядрами, які чергуються з меристематичними ділянками.

Для індукції паросткоутворення, калуси переносять на середовища для регенерації: МС + кінетин - 1-2 мг/л, 6-БАП - 3-6 мг/л, аденін - 1-2 мг/л, ГК - 1-2 мг/л, ферулова кислота - 0,5-0,7 мг/л, ІОК - 0,2-0,4 мг/л, НОК - 0,2-0,4 мг/л, ІМК - 0,2-0,4 мг/л, 2,4-Д - 0,1-0,3 мг/л.

Через 1,5-2 місяці культивування морфогених калусів на 16-ти годинному фотоперіоді при освітленості 3 кLх починається проліферація бруньок і пагонів. Морфогенні калуси страхують кожні 4-6 тижнів.

Пагони-регенеранти, отримані з пилкових калусів, неоднорідні за морфологічними ознаками. Це обумовлено гетерогенністю калусів. Тому необхідно проводити цитологічне вивчення і калусів і рослин-регенерантів.

 

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, спиртівки, флакони з 96 % спиртом, пробірки з пилковими калусами, пробірки з середовищами для отримання морфогенного каллусу, пробірки з середовищами для регенерації, препарувальні голки, пінцети.

 

Хід роботи.

1. В умовах ламінар-боксу витягнути калус з пробірки і перенести на стерильну поверхню. Стерильною препарувальною голкою виділити зону морфогенного калусу (білі дрібні клітини, калус середньої щільності).

2. Стерильною препарувальною голкою перенести шматочок (5-6 мм) морфогенного каллусу в пробірку з середовищем для регенерації, закрити пробірку стерильною пробкою.

3. Перенести штативи з пробірками у світлову культуральну кімнату з температурою 25 + 2^о С, вологістю 70 %, освітленістю 4 кLх.

4. Через 4-6 тижнів замалювати результати роботи.

5. Пагони перенести в пробірки з середовищами для проліферації пагонів: МС +1-2 мг/л 6-БАП, 1 мг/л НОК.

6. Перенести пагони на середовища для індукції коренеутворення: МС без гормонів, МС +1-2 мг/л ІМК + 1мг/л ГК і помістити на 20 днів в темряву.

 

Контрольні питання до теми VI.

1. Для чого використовуються гаплоїди в селекції і генетиці?

2. Як отримати морфогенний калус з пильників?

3. Які основні способи отримання гаплоїдних і дигаплоїдних рослин-регенерантів?

Додаток

Таблиця 1.

Приготування маточних розчинів для середовища Мурасіге-Скуга.

№ п.п.	Компонент середовища	Кількість речовини
	Маточний розчин макросолей (г на 1 л маточного розчину)
1. 2. 3. 4.	KNO3 NH4NО3 KH2PO4 MgSO4 ^. 7H2O або MgSO4 безводний	3,4 7,4 3,6
5.	CaCl2 ^. 2H2O або CaCl2 безводний	8,8 6,65
	Маточний розчин мікросолей (мг на 100 мл маточного розчину)
6. 7. 8. 9.   10. 11. 12.	Na2MoO4 ^. 2H2O CuSO4 ^. 5H2O H3BO3 MnSO4 ^. 5H2O або MnSO4 ^. 4H2O ZnSO4 ^. 7H2O KJ CoCl2 ^. 6H2O	2,5 2,5
13.	FeSO4 Na2 ЕДТА

 

Таблиця 2

Середовище Мурасіге-Скуга (М-С) для клітинних і тканинних культур

Компоненти поживного середовища
Маточний розчин макросолей Маточний розчин мікросолей Fe-хеллат CaCl2 Тіамін-HCl Піридоксин-HCl Нікотинова кислота Мезоінозит Гліцин Сахароза	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 0,1 мг/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 100 мг/л 2 мг/л 30 г/л
рН 5,6-5,8

 

Таблиця 3

Модифіковане поживне середовище Мурасіге-Скуга для
культивування апікальних меристем картоплі

Компоненти поживного середовища
Маточний розчин макросолей Маточний розчин мікросолей Fe-хеллат CaCl2 Тіамін-HCl Піридоксин-HCl Вітамін В12 Нікотинова кислота Фолієва кислота Мезоінозит Гідролізат казеїну Аденін Пантотенат Са Рибофлавін Біотин Активоване вугілля ГК Кінетин Сахароза Глюкоза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 1 мг/л 1 мг/л 0,015 мг/л 2 мг/л 0,5 мг/л 100 мг/л 1 г/л 40 мг/л 10 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 10 г/л 2 мг/л 0,5 мг/л 20 г/л 20 г/л 7 г/л
рН 5,7-5,8

 

Таблиця 4

Модифіковане поживне середовище Мурасіге-Скуга для
мікророзмноження картоплі черенкуванням пагонів

Компоненти поживного середовища
Маточний розчин макросолей Маточний розчин мікросолей Fe-хеллат CaCl2 Тіамін-HCl Піридоксин-HCl Нікотинова кислота Аденін Кінетин Гіббереллова кислота Пантотенат Са Активоване вугілля Сахароза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 1 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 40 мг/л 0,5 мг/л 2 мг/л 10 мг/л 10 г/л 30 г/л 7 г/л
рН 5,8

 

Таблиця 5

Приготування маточних розчинів для середовища Гамборга-Евелега.

№ п.п.	Компонент середовища	Кількість речовини
	Маточний розчин макросолей (г на 1 л маточного розчину)
1. 2. 3. 4.	KNO3 (NH4)2SO4 MgSO4 ^. 7H2O NaH2PO4 ^. H2O	2,68 10,0 3,0
5.	CaCl2 ^. 2H2O	3,0
	Маточний розчин мікросолей (мг на 100 мл маточного розчину)
6. 7. 8. 9. 10. 11.	Na2MoO4 ^. 2H2O CuSO4 ^. 5H2O H3BO3 MnSO4 ^. H2O ZnSO4 ^. 7H2O CoCl2 ^. 6H2O	7,5 2,5
12.	FeSO4 Na2 ЕДТА

Таблица 6

Середовище Гамборга-Евелега

Компоненти поживного середовища
Маточний розчин макросолей Маточний розчин мікросолей Fe-хеллат CaCl2 Тіамін-HCl Піридоксин-HCl Нікотинова кислота Мезоінозит 2,4-Д Сахароза	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 10 мг/л 1 мг/л 1 мг/л 100 мг/л 2 мг/л 20 г/л
рН 5,8

 

Таблиця 7

Модифіковане поживне середовище Мурасіге-Скуга для бульбоутворення у картоплі.

Компоненти поживного середовища
Маточний розчин макросолей Маточний розчин мікросолей Fe-хеллат CaCl2 Тіамін-HCl Піридоксин-HCl Нікотинова кислота Аскорбінова кислота Кінетин Сахароза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 1 мг/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 0,5 мг/л 50 г/л 7 г/л
рН 5,8-6,0

 

 

Таблиця 8

Приготування маточних розчинів для середовища Блейдза.

№ п.п.	Компонент середовища	Кількість речовини
	Маточний розчин макросолей (г на 1 л маточного розчину)
1. 2. 3. 4. 5.	KNO3 KCl KH2PO4 NH4NO3 MgSO4 ^. 7H2O або MgSO4 безводний	1,3 1,44 0,7
6.	Ca(NO3)2 ^. 4H2O	10,28
	Маточний розчин мікросолей (мг на 100 мл маточного розчину)
7. 8.   9. 10.	H3BO3 MnSO4 ^. H2O або MnSO4 ^. 5H2O ZnSO4 ^. 7H2O KJ
11.	FeSO4 Na2 ЕДТА

 

Таблица 9

Середовище Блейдза для калусогенезу.

Компоненти поживного середовища
Маточний розчин макросолей Маточний розчин мікросолей Fe-хеллат CaNO3 Тіамін-HCl Піридоксин-HCl Нікотинова кислота Аскорбінова кислота Мезоінозит 2,4-Д Сахароза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 1 мг/л 0,1 г/л 2 мг/л 20 г/л 7 г/л
рН 6,0

Таблица 10

Середовище Блейдза для соматичного ебріогенезу.

Компоненти поживного середовища
Маточний розчин макросолей Маточний розчин мікросолей Fe-хеллат CaNO3 Тіамін-HCl Піридоксин-HCl Нікотинова кислота Аскорбінова кислота Мезоінозит ІОК Кінетин АБК Сахароза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 2,5 мл/л 50 мл/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 1 мг/л 0,1 г/л 0,2 мг/л 0,2 мг/л 0,05 мг/л 20 г/л 7 г/л
рН 6,0

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

 

1. Бутенко Р.Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений //Рост растений и природные регуляторы – М.: Наука, 1977.

2. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. – М.: Наука, 1986.

3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие – М.: ФБК-ПРЕСС, 1999.

4. Гамбург К.3., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений – Новосибирск: Наука, 1990.

5. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений – Киев: Наукова думка, 1984.

6. Калинии Ф.Л., Бутенко Р.Г. Методы культуры тканей в физиологии растений – Киев: Наукова думка, 1980.

7. Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений – Киев: Наукова думка, 1992.

8. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений – М.: Наука, 1983.

9. Клеточная инженерия /Р.Г. Бутенко, М.В. Гусев, А.Ф. Киркин //Биотехнология.

 

 

 

Навчальне видання

Методичні вказівки з курсу “Технологія біологічно активних речовин ” для студентів спеціальності 7(8) 110204 “Технологія фармацевтичних препаратів”

 

Укладачі:

Наталія Євгенівна Стадницька

Марина Володимирівна Стасевич

Оксана Богданівна Миколів

Володимир Павлович Новіков