Рослинного матеріалу на вміст вірусів

Теоретичні відомості

Принцип методу ІФА полягає в наступному: до одного з компонентів антиген-антитіло приєднують фермент, інший компонент сорбують на твердій фазі. Потім проводять реакцію нейтралізації, додають субстрат і визначають активність комплексу. Активність ферменту, тобто кількість комплексів, що утворилися, антиген-антитіло пропорційне змісту вірусів.

Для аналізу використовують полістеролові плата, в лунки яких додають сироватку і антитіла, отримані на основі тестованих вірусів з крові ссавців.

Антитіла адсорбуються на поверхні осередків плата протягом 6 годин. Залишки сироватки видаляють спеціальним буфером. Потім в лунки вносять досліджувальні витяжки рослин (сік листя, бульб). За наявності вірусного зараження утворюється комплекс вірус-антитіло. Обов'язково готують контрольні плата (без зараження). Після промивання буфером в осередки додають антитіла в комплексі з ферментами: фосфотазою і пероксидазою. У присутності вірусу на поверхні плата утворюється комплекс антиген-антитіло-фермент. Якщо матеріал стерильний, комплекси не утворюються, а залишки ферменту відмиваються буфером. Після усіх описаних вище маніпуляцій в лунки плата додають субстрат, на якому працює фермент (для фосфотази потрібні еритроцити крові, які руйнуються в її присутності).

В результаті реакції між ферментом і субстратом забарвлення розчинів в лунках плата змінюються залежно від міри зараження вірусом: немає забарвлення - "-" - вірус відсутній, світло-коричневе забарвлення - "+" - середнє зараження вірусом, яскраво-коричневе забарвлення -"++" - висока ступінь зараження вірусом.

Для успішного тестування вірусів необхідно створити стандартні умови, використовувати високоякісні антитіла, ферменти, плата.

Матеріали і устаткування. Полістеролові плата, рослинні екстракти, гомогенізатор, сироватки, розчини ферментів, кров ссавців, буферний розчин, центрифуга, рослинний матеріал.

 

Хід роботи.

1. Рослинний матеріал гомогенізують і центрифугують.

2. Заповнити сироваткою полістеролові плата і залишити для інкубації на 6 годин.

3. Промити плата буфером.

4. Внести до лунок плата центрифугат і залишити для інкубації на 1 годину.

5. Промити плата буфером.

6. Заповнити плата сироваткою з ферментом і залишити на 1 годину.

7. Промити плата буфером.

8. Внести до лунок субстрат для ферменту.

9. Протестувати зміну забарвлення в лунках плата за шкалою.

10. Відібрати зразки без вірусів, із слабкою мірою зараження і з сильним зараженням вірусом.

11. Результати тестування замалювати, зробити висновки про якість посадкового матеріалу.

 

 

Робота 6. ОТРИМАННЯ БЕЗВІРУСНОГО ПОСАДКОВОГО МАТЕРІАЛУ МЕТОДОМ ТЕРМОТЕРАПІЇ У ПОЄДНАННІ З КУЛЬТИВУВАННЯМ АПІКАЛЬНИХ МЕРИСТЕМ

 

Теоретичні відомості

У разі зараження посадкового матеріалу вірусами застосовують термотерапію. Заздалегідь бульби без бактерійних і грибкових інфекцій тестують ІФА. Потім їх розміщують в кюветах із стерильним піском і пророщують 1-2 тижні при температурі 28-30^оС, 4 тижні при температурі 37-38^оС і вологості повітря 70-80 %. Двічі в день пісок зволожують, через 7-10 днів проводять підживлення розчином Кнопа і мікроелементів по пропису Мурасіге-Скуга: 5 мл маточного розчину на 1 л розчину Кнопа. Бульби жаротривких сортів можна відразу вирощувати при температурі 37-38^оС і вологості повітря 70 %.

Режим теплової обробки для кожного сорту підбирають експериментально. У випадках зараження рослин мозаїчними, веретеновидними, нитчастими, паличкоподібними вірусами термічна обробка малоефективна. Тому додатково використовують біотехнологічні методи: метод апікальних меристем. Для цього перед термообробкою верхівки рослин картоплі зрізають і поміщають на 5 годин в розчин гетероауксину (50 мг/л). Вкорінені проростки поміщають в культуральні камери або кімнату з температурою повітря 37^оС, грунти - 30-32^оС, з фотоперіодом 16 годин на 4-6 тижнів.

Термообробку зазвичай проводять восени і зимою. Навесні з рослин вичленовують пазушні бруньки від 0,3 до 1 мм і висаджують на поживні середовища (МС без гормонів, pH 5,7).

 

Матеріали і устаткування. Бульби картоплі, кювети з піском, флакони з водою, кювети з пророщеними рослинами, що пройшли термотерапію, ламінар-бокс, бінокулярний мікроскоп МБС-9 або МБС-10, стерильні скальпелі, препарувальні голки, флакони з 96 % спиртом, хлораміном, спиртівки, пробірки з поживними середовищами.

 

Хід роботи.

1. Здорові бульби картоплі ретельно промити проточною водою.

2. Бульби обробити стерилізуючим розчином (спирт, хлорамін), промити проавтоклавованою водою.

3. Вирізувати очка з частиною паренхіми (1,5 г 1,5 см) і помістити в кювети для пророщування і термотерапії.

4. Проростки, що пройшли термотерапію, помістити в 6 % розчин хлораміну на 5 хвилин, промити стерильною дистильованою водою.

5. У ламінар-боксі під мікроскопом вичленувати апікальні меристеми і помістити їх в пробірки з поживними середовищами.

6. Увесь рослинний матеріал перенести в культуральну кімнату.

7. Результати замалювати через 2-4-6-8 тижнів.

 

 

Робота 7. ОТРИМАННЯ БЕЗВІРУСНОГО ПОСАДКОВОГО МАТЕРІАЛУ МЕТОДОМ ХІМІОТЕРАПІЇ У ПОЄДНАННІ З МЕТОДОМ

АПІКАЛЬНИХ МЕРИСТЕМ.

Теоретичні відомості

Для хіміотерапії використовують спеціальні речовини-інгібітори вірусів: ферменти, що впливають на нуклеїнові кислоти (РНК-ази). Безпосередню обробку бульб ферментом можна проводити методом інфільтрації у вакуумній камері протягом 20 хвилин, що призводить до великої витрати речовини. Тому ефективніше додавати РНК-ази в поживні середовища для культивування апексів.

РНК-аза стимулює зростання і розвиток рослин з апексів та інгібує розвиток вірусів. В результаті застосування такої технології вирощування на 10-35 % підвищується приживання меристем на поживних середовищах, на 30-40 % більше утворюється рослин-регенерантів.

 

Матеріали і устаткування. Пробірки з поживними середовищами, ламінар-бокс, фільтри Зейтца, стерильна бідистильована вода, флакони з 96 % спиртом, спиртівки, мікроскопи МБС-9 або МБС-10, стерильні інструменти (скальпелі, препарувальні голки, пінцети), розчин РНК-ази (0,01 н), хімічний посуд (колби на 50-100 мл, склянки на 50-100 мл, мірні циліндри), проростки картоплі.

 

Хід роботи.

1. Розчин РНК-ази профільтрувати через фільтр Зейтца, додати в 100 мл середовища Мурасиге-Скуга і розлити в пробірки із застиглим стерильним середовищем до 0,5 см

2. Простерилізувати проростки картоплі в 6 % хлораміні 5 хвилин.

3. Проростки промити стерильною дистильованою водою і помістити в стерильні чашки Петрі.

4. В умовах ламінар-боксу під мікроскопом вичленувати апікальні меристеми і помістити на середовища без ферменту (контроль) та з ферментом (досвід).

5. Пробірки з меристемами перенести в культуральну кімнату.

6. Результати замалювати через 2-4-6 тижнів, зробити висновки.

 

Контрольні питання до теми 2.

1. Що таке мікроклональне розмноження рослин: основні етапи?

2. Які основні способи мікроклонального розмноження?

3. Як отримати безвірусний посадковий матеріал?

4. Який із способів отримання безвірусного посадкового матеріалу ви б вважали кращим у своїй роботі?

5. Чим відрізняються поживні середовища для проліферації пагонів, індукції корнеутворення, культивування меристем, отримання мікробульб?

6. Як протестувати посадковий матеріал на міру зараження вірусами?

 

 

ТЕМА Ш. ДЕДИФЕРЕНЦІАЦІЯ І КАЛЛУСОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРІ РОСЛИННИХ КЛІТИН І ТКАНИН.

 

Робота 1. ОТРИМАННЯ КАЛЛУСІВ З ЛИСТЯ ТЮТЮНУ.

 

Теоретичні відомості

Калусна клітина, в результаті ділення якої виникає калус, є одним з типів клітинного диференціювання. Для рослини in vivo каллус - це група клітин, що виникає при травмах і захищає місце поранення (ранева паренхіма). У ній накопичуються поживні речовини для регенерації анатомічних структур або втраченого органу.

Диференційовані клітини об'єднуються у рослині в тканини і виконують певні функції. Клітини розрізняються не лише функціонально, але і морфологічно.

На поживних середовищах з великим вмістом ауксинів (2,4 Д) клітини експланту дедиференціюються і переходять до проліферації. Особливості дедиференціації клітин експланту залежать від генетики і епігенетики експланту. Клітини втрачають колишні функції і морфологію. Причому, чим менше структурно і хімічно диференційована клітина, тим легше отримати калус.

У клітині, підготовленій до ділення, стимулюється синтез усіх форм РНК, починається реплікація ДНК, зникають специфічні тканинні білки-антигени, синтезуються нові, специфічні для каллусних клітин. Міняється активність структурних генів і білкового апарату клітин. Дедиференціація спеціалізованих клітин починається із збагачення їх елементами цитоплазми: мікротрубочками, мембранами ЕПС і комплексу Гольджі, рибосомами, зникають хлоро- і хромопласти, продукти їх діяльності; може утворюватися багато ядер або збільшуватися число хромосом; збільшуватися вакуолі.

Калус, що вирощується поверхневим способом, є аморфною масою тонкостінних паренхімних клітин, що не має строго визначеної структури. Клітини калусу або безбарвні, або мають жовтуватий відтінок. Залежно від походження і умов культивування розрізняють калуси: рихлі, з сильно оводненими клітинами, що легко відділяються один від одного; середньої густини, із зонами меристематичної активності; щільні, із зонами зредукованого камбію і судин.

У біотехнології, для відпрацювання методик культивування, частіше усього використовують ті види рослин, які і в звичайних умовах легко вкорінюються, регенерують, утворюють калус. Тому більшість методів отримання і культивування калусу розроблена для тютюну. Калуси можна отримати практично з будь-якої частини рослини, оскільки клітини тютюну легко дедиференціюються і переходять до проліферації. Для культивування калусів з листя тютюну використовують середовище Мурасіге-Скуга з додаванням ауксинів (2,4 Д).

 

Матеріали і устаткування. Рослини тютюну, 6% розчин хлораміну, колби із стерильною дистильованою водою, чашки Петрі із стерильним поживним середовищем для індукцій калусогенезу.

 

Хід роботи.

1. Листя тютюну помістити в стерилізуючий розчин на 5 хв, потім промити стерильною дистильованою водою 3 рази.

2. Стерильним скальпелем вирізати серединну жилку листа з ділянкою паренхіми: завдовжки 1,5-2 см, шириною 1 см.

3. Помістити експланти на поживні середовища (перед кожною маніпуляцією інструменти обробляти спиртом і обпалюють на полум'ї спиртівки).

4. Чашки Петрі з експлантами перенести в термостат для індукцій калусогенезу при температурі 25 + 2^о С.

5. Результати замалювати через 2-4 тижні.

 

Робота 2. ОТРИМАННЯ КАЛУСІВ З НЕЗРІЛИХ ЗАРОДКІВ І

ВУЗЛІВ КУЩІННЯ ПШЕНИЦІ

Теоретичні відомості

Калуси з різних органів пшениці на штучних поживних середовищах уперше були отримані в 1968 році. Їх можна використовувати для вивчення солестійкості, стійкості до температурного стресу, отримання суспензій і протопластів.

Для індукції калусогенезу зазвичай використовують стерильні пробірні рослини, вирощені із зародків на середовищах без гормонів.

Рослини для отримання калусів можна виростити в теплиці. Для цього набрякле насіння поміщають на 5 тижнів в холодну камеру на яровизацію при 2^оС, проростки висаджують у вегетаційні посудини і вирощують до досягнення молочної стиглості. Незрілі зародки виділяють і переносять на поживні середовища.

 

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, пробірки з поживним середовищем, пробірки із стерильними рослинами, колоси пшениці у стадії молочної стиглості, інструменти: препарувальні голки, пінцети, скальпелі, стерильний папір, 6% розчин хлораміну, стерильна дистильована вода, спиртівки, флакони з 96 % спиртом.

 

Хід роботи.

1. Незрілі зернівки помістити в стерилізуючий розчин на 5 хвилин.

2. Промити 3 рази стерильною дистильованою водою.

3. Простерилізовані зернівки помістити на стерильні паперові місточки.

4. Препарувальною голкою вичленувати зародки і перенести в пробірки з поживними середовищами.

5. Пробірки із зародками закрити пробками і поставити в штатив.

6. Пробірні рослини пшениці викласти на стерильні паперові матрацики і розрізати на невеликі частини по 5-10 мм, виділити меживузля з ділянками листкової піхви.

7. Перенести експланти на поживні середовища МС+2,4Д в концентрації 4мг/л.

8. Замалювати калуси через 2-4 тижні, зробити висновки про морфологію калусів, розглянути калусні клітини під мікроскопом.

 

 

Робота 3. ОТРИМАННЯ КАЛУСІВ З КОРІНЦІВ КВАСОЛІ.

 

Теоретичні відомості

Калуси можна отримувати з різних частин рослини, у тому числі з кінчиків коріння. Утворення калусу відбувається в ділянці первинних і вторинних меристем. Процес калусоутворення залежить від розміру експланту. Оптимальна величина експланту 5-10 мм² і маса 20-100 мг.

Багато тканин мають фізіологічну полярність. Тому калус краще утворюється на тій стороні експланту, яка ближче до апікальних меристемам кореня. Кінчики коріння легко утворюють калус, якщо вони поміщені на середовище горизонтально, тоді як сегменти стебла краще формують калус, якщо їх помістити вертикально.

Для культивування на поживних середовищах краще використовувати стерильні корінці, отримані при пророщуванні насіння в стерильних умовах.

 

 

Матеріали і устаткування. Насіння квасолі, 6% розчин хлораміну, стерильні інструменти: пінцети, скальпелі, препарувальні голки, чашки Петрі з поживними середовищами для індукції калусогенезу, стерильні чашки Петрі, флакони із спиртом і стерильною дистильованою водою.

 

Хід роботи.

1. Насіння квасолі помістити в чашки Петрі (по 15 штук в чашку), залити розчином хлораміну до повного занурення насіння в рідину і залишити на 20 хвилин.

2. Промити насіння стерильною дистильованою водою 3 рази.

3.Стерильне насіння залити стерильною водою і залишити для набрякання на 24 години.

4. Насіння із зруйнованою шкіркою видалити, а життєздатне насіння простерилізувати повторно 6% хлораміном 20 хвилин.

5. Промити насіння стерильною дистильованою водою 3 рази.

6. Насіння перенести в стерильні чашки Петрі (по 5 штук в чашку).

7. Стерильним пінцетом притримувати насіння, а стерильним скальпелем надрізати оболонку.

8. Стерильним скальпелем і препарувальною голкою ізолювати корінці (2-3 мм) і перенести в чашки Петрі із стерильною дистильованою водою (по 15 штук в чашку).

9. Корінці стерильною препарувальною голкою помістити на поверхню агаризованого середовища і злегка втиснути в агар для забезпечення хорошого контакту з середовищем (середовище ШХ+10 мг/л п-ХФУК+2 мг/л 2,4Д+0,1 мг/л кінетина).

 

 

Робота 4. СУБКУЛЬТИВУВАННЯ КАЛУСІВ.

Теоретичні відомості

У циклі вирощування калусні клітини після ряду ділень проходять звичайний онтогенез: ростуть розтягуванням, диференціюються і деградуюють. Ріст калусу зовні відображає S-подібна крива. Ростовий цикл починається з посадки експланту на середовище (початок культивування), а завершується у момент припинення мітозів (стаціонарна фаза).

У лагфазі (латентній фазі) клітини не діляться, не збільшуються в розмірі, мають низьку метаболічну активність. У експоненціальній фазі (фазі логарифмічного росту) клітини активно діляться мітозом. У ранній експоненті збільшується кількість мітохондрій (синтезується АТФ), рибосом, усіх видів РНК, синтезуються білки, активізується метаболізм, інтенсивно поглинається кисень. Пізня експонента або фаза латентного росту, характеризується зниженням питомої швидкості росту, уповільненням клітинного ділення, збільшенням середнього розміру клітин за рахунок розтягування. У стаціонарній фазі розмір клітин продовжує збільшуватися, а їх ділення припиняється. У пізній стаціонарній фазі (фаза деградації) за рахунок виснаження середовища клітини старіють і помирають.

Тривалість ростового циклу калусних клітин 21-28 днів. У процесі культивування калус страхують (пересаджують на свіже поживне середовище) кожні 4-6 тижнів. Маса транспланту (фрагменту тканини, який страхують на свіже поживне середовище) складає 60-100 мг на 20-40 мл середовища.

 

Матеріали і устаткування. Пробірки з калусами, пробірки з поживним середовищем для культивування калусів, інструменти: пінцети, препарувальні голки, флакон з 96 % спиртом, ламінар-бокс, спиртівка.

 

Хід роботи.

1. У асептичних умовах витягнути каллуси з пробірок і помістити на стерильну поверхню (столик ламінар-боксу, оброблений 96% спиртом і УФ-опроміненням), стерильною препарувальною голкою виділити зони меристематичної активності (білі дрібні клітини).

2. Транспланти розміром 2-3 мм помістити на поверхню поживного середовища (МС+ІОК - 0,5 мг/л + кінетин - 0,5 мг/л).

3. Результати культивування замалювати через 2-4 тижні, за результатами зважувань через 1-2-3-4 тижні побудувати графік росту калусу.

 

Контрольні питання до теми Ш.

1. Назвати основні способи культивування калусів.

2. Що таке дедиференціація і проліферація клітин?

3. Чим характеризуються основні фази ростового циклу калусу?

4. Чи відрізняються за морфологією калуси різних видів рослини?

5. Для яких цілей використовують культуру калусів в біотехнології, генетиці і селекції?

6. Які поживні середовища використовують для індукції калусогенезу і культивування калусів?