Робота 3. Визначення міри агрегації і

ЖИТТЄЗДАТНОСТІ СУСПЕНЗІЇ.

 

Теоретичні відомості

Залежно від мети дослідження умови культивування склад поживного середовища підбирають так, щоб в суспензії переважала певна фракція клітин. Зазвичай в суспензії розрізняють 4 основних фракції: поодинокі клітини, дрібні агрегати, середні агрегати, великі агрегати. Міру агрегації визначають, підраховуючи клітини в декількох полях зору на тимчасових препаратах під малим збільшенням мікроскопа (не менше 1000 клітин).

При роботі з суспензіями необхідно враховувати і її життєздатність. Про життєздатність клітин можна судити за рухом цитоплазми, по мірі проникності клітинної стінки для барвників, за активністю ферментів.

Прижиттєві барвники, такі як метиленовий синій, клітини не вбивають і через оболонки живих клітин в цитоплазму не проникають. Суспензія рахується життєздатної, якщо більше 70 % клітин не забарвлюються в синій колір; агрегат життєздатний, якщо більше 50 % його клітин не забарвилися.

Для кількісного визначення життєздатності суспензії використовують речовини, що беруть участь в метаболізмі клітини: флуоресцеїндіацетат розщеплюється в клітині естеразами з утворенням флуоресцеїну, що дає флуоресценцію цитоплазми живих клітин. Активність естерази визначають на спектрофотометрі. Фарбування клітини солями тетразоля дозволяє визначити інтенсивність дихання клітини.

 

Матеріали і устаткування. Мікроскоп, флакон з 0,1 % розчином метиленового синього, предметні і покривні скельця, фільтрувальний папір, дистильована вода, марлеві серветки, піпетки.

 

Хід роботи.

1. Приготувати препарат суспензії: струсити суспензію в колбі, піпеткою відібрати невелику кількість суспензії, помістити краплю суспензії на предметне скло, додати краплю барвника, накрити покривним склом, надлишок рідини забрати фільтрувальним папером.

2. Помістити препарат на столик мікроскопа під мале збільшення об’єктиву і підрахувати клітини і агрегати в 3-х полях зору (проглянути не менше трьох препаратів).

3. Результати записати в таблицю.

4. Один препарат замалювати, описати морфологію клітин суспензії (форму, розмір).

5. Зробити висновок про міру агрегування суспензій (які фракції переважають, %) і життєздатності суспензії (незабарвлених клітин, %).

 

Таблиця.

Ступінь агрегації і життєздатності суспензії.

 

Фракції

Препарати

Поля зору

з

н

з

н

з

н

з

н

з

н

з

н

з

н

з

н

з

н

поодинокі клітини

дрібні агрегати (2-5 клітин)

середні агрегати (6-20 клітин)

великі агрегати (21-50 клітин)

дуже великі агрегати (50 і більше клітин)

Примітка: з – забарвлені клітини та агрегати,

н – незабарвлені клітини та агрегати.

 

 

Робота 4. ОТРИМАННЯ КЛІТИННИХ КЛОНІВ НА АГАРИЗОВАНИХ СЕРЕДОВИЩАХ. МЕТОД ПЛЕЙТИНГА.

Теоретичні відомості

Культивування окремих (поодиноких) клітин дозволяє отримувати клони і досліджувати генетичну та фізіологічну стабільність або мінливість клонового матеріалу. Поодинокі клітини або ізольовані протопласти використовуються в клоновій селекції, гібридних і трансформованих ліній мутантів. У ці клітини можна ввести нові гени, в той же час - це хороша модель для вивчення онтогенезу і фізіології клітини.

Джерелом окремих (поодиноких) клітин є клітинні суспензії, які ростуть на рідкому поживному середовищі; мацеровані тканини рослин (мезофіл листа); ізольовані протопласти після відновлення клітинної стінки.

Найбільш ефективними методами для отримання поодиноких клітин є: метод "годуючого шару" або "культури-няньки", кондиціонованих середовищ, мікрокрапель. Для отримання генетично стабільних клонів і клітинної селекції використовується метод Плейтинга.

 

Матеріали і устаткування. Колби з суспензією, стерильні чашки Петрі, стерильний циліндр, чашки Петрі з агаризованим середовищем, інструменти: пінцети, препарувальні голки, спиртівка, 96 % спирт.

 

Хід роботи.

1. Піпеткою відібрати 5 мл верхньої фракції суспензії (у верхньому шарі суспензії переважає фракція поодиноких клітин) і змішати з 5мл агаризованого (1,4 % агару) середовища для культивування калусу. Роботу проводити в стерильному посуді: мірному циліндрі, склянці.

2. Отриману суміш розлити в стерильні чашки Петрі шаром до 1 см.

3. Чашки Петрі закрити кришками і герметизувати парафіном.

4. Кількість колоній підрахувати через 4-6 тижнів.

5. Результати замалювати, підрахувати густину висіву за формулою:

 

кількість колоній, які утворились

Ефективність висіву = ´ 100 %

кількість висіяних клітин

Контрольні питання до теми IV.

1. Що таке суспензійні культури і які основні способи їх одержання?

2. Як визначити міру агрегації і життєздатності суспензій?

3. Як підрахувати густину суспензії?

4. Які основні способи культивування одноклітинних суспензій?

5. У яких галузях виробництва і науки використовують суспензійні культури?