Отримання безвирусного посадочного матеріалу.

 

Робота 1. ВИЧЛЕНЕННЯ АПІКАЛЬНИХ МЕРИСТЕМ І

РЕГЕНЕРАЦІЯ РОСЛИН

Теоретичні відомості

У культурі тканин можна розмножувати рослини і отримувати оздоровлений (безвірусний) посадковий матеріал. Для оздоровлення рослин використовують культуру апексів або культуру апікальних меристем, оскільки в стебловий апекс віруси проникають повільніше, ніж в інші частини рослин. При культивуванні апексів розмноження вірусів пригнічується реакцією рослинного організму на травму, викликану відсіканням верхівки. Зазвичай на поживні середовища висаджують невелику частину меристеми до 0,5 мм.

В цілому закономірність така: чим менше величина меристеми, тим більше вірогідність отримання безвірусних рослин.

Біотехнологія дозволяє отримувати безвірусний посадковий матеріал практично усіх сільськогосподарських культур. Найбільш повно розроблена технологія отримання безвірусного матеріалу картоплі. Система первинного насінництва і оздоровлення посадкового матеріалу картоплі включає наступні етапи: підготовка бульб для вичленення апікальних меристем, вичленення апікальних меристем, регенерація рослин з меристем, адаптація рослин-регенерантів в захищеному грунті, отримання первинної продукції безвірусного матеріалу у відкритому грунті, вирощування безвірусного посадкового матеріалу в первинних ланках насінництва, збереження колекції сортів.

У культурі тканин використовуються апекси верхівкових і бічних бруньок. Щоб виключити вплив метаболитів бульби на проростки і підвищити регенерацційну здатність початкового матеріалу з середньої частини бульби вирізають очка з частиною паренхіми (1,5 г 1,5 см). Очка пророщують на піску, заздалегідь обробленому сухим жаром. Етіольовані проростки вирощують в темряві при температурі 25 + 2^оС, вологості повітря 70-80 %. Пісок двічі в день зволожують, через 7-10 днів проводять підгодівлю розчином Кнопа.

Апікальні меристеми проростків ізолюють на 12-13 пластохроні (пластохрон - проміжок часу між ініціаціями двох листових горбків. В середньому від посадки меристеми на середовище до формування проростків з 5-6 листочками проходить 30-45 днів, в деяких випадках від 2 до 8 місяців. Середовища по мірі виснаження оновлюють, і проростки періодично пересаджують на нові середовища в стерильних умовах).

 

Ізольовані меристеми культивують в асептичних умовах на поживних середовищах з багатим вмістом макро- і мікросолей, з підвищеною концентрацією цитокінінів (6-БАП 2 мг/л). У культуральній кімнаті з кондиціонованим повітрям підтримують температуру 25 + 2^оС, вологість повітря 70 %, освітленість 5 кLx і фотоперіод 16 годин.

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, бінокулярний мікроскоп МБС- 9 або МБС- 10, флакони із стерилізуючими розчинами, (0,2 % діацид або 70 % спирт), чашки Петрі, стерильна дистильована вода, стерильні інструменти: пінцети, препарувальні голки, скальпелі, спиртівка, пробірки з середовищем.

 

Хід роботи.

1. Поверхня ламінару, штативи, пробірки, мікроскоп обробити ультрафіолетом і 96 % спиртом. Руки протерти спиртом. Препарувальні голки, пінцети, скальпелі помістити в 96 % спирт і перед кожною маніпуляцією обпалювати на полум'ї спиртівки.

2. Проростки (2 см) відокремити від бульб і помістити в чашки Петрі із стерилизуючими розчинами: в діацид на 3-5 хвилин, в спирт на 1-2 хвилини.

3. Проростки промити 3 рази стерильною дистильованою водою і перенести в стерильні чашки Петрі.

4. Тонкою препарувальною голкою у проростків видалити усе листя, послідовно оголяючи верхівкові і бічні меристеми з примордіями.

5. Меристему з 1-2 примордіями відокремити від проростків, при цьому розмір експланту має бути не більше 100-250 мкм.

6. Експланти перенести в пробірку на поверхню поживного середовища.

7. Пробірки закрити пробками, помістити в штатив і перенести в культуральную кімнату.

8. Результати замалювати через 2-4 тижні, зробити висновки.

 

 

Робота 2. ПРОЛІФЕРАЦІЯ ПАГОНІВ І МІКРОЖИВЛЕННЯ

СТЕРИЛЬНИХ ПРОРОСТКІВ.

Теоретичні відомості

Мікроклональне розмноження пробірних рослин здійснюють за допомогою живлення. Таке розмноження засноване на пригніченні апікального домінування і активації пазушних меристем при видаленні верхівки пагони. З пазушних бруньок на поживних середовищах утворюються пагони. Рослини, що сформували 5-6 листочків, в стерильних умовах виймають з пробірок і розрізають на частини (відрізок стебла з листом і пазушною брунькою). Живці висаджують на глибину меживузля в поживні середовища або без гормонів, або з додаванням ауксинів.

Живці культивують в тих же умовах, що і меристеми: при температурі 24-25^оС вдень і 19-20^оС вночі, освітленості 5-6 кLx і тривалість фотоперіоду 16 годин.

Ріст стебла і коріння починається на 3-4 день після посадки на поживне середовище, а повністю рослини формуються через 12-15 днів.

Кожне наступне живцювання проводять через 14-20 днів. З однієї рослини можна отримати 5-8 живців, а через 2-3 місяці - 3-5 тис. живців.

Нижню частину рослини використовують для ІФА. Рослини, заражені вірусами, бракують, а здорові дають початок мериклонам (меристематичним клонам).

Якщо бруньки або живці висадити на поживні середовища з високим вмістом цитокінінів, то утворюється конгломерат бруньок і пагонів. Отримані пагони легко відділяються один від одного, їх можна або укоренити, або використовувати для подальшого мікроживцювання.

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, пробірки з проростками, пробірки з поживним середовищем, скальпелі, препарувальні голки, спиртівка, флакон з 96 % спиртом.

 

Хід роботи.

1. Підготувати ламінар-бокс і інструменти до роботи.

2. У ламінарі витягнути стерильні проростки з пробірок.

3. Пагони розділити на мікроживців (меживузля з брунькою) і посадити в поживне середовище на глибину меживузля.

4. Пробірку закрити пробкою, помістити в штатив і перенести в культуральну кімнату.

5. Результати замалювати через 2-4 тижні. Зробити висновки про міру проліферації бруньок різних сільськогосподарських культур.

 

Робота 3. ІНДУКЦІЯ КОРЕНЕУТВОРЕННЯ ПРИ