Деякі недоліки використання сироватки при культивуванні клітин

Не дивлячись на те, що було сказано вище, культивування клітин у присутності сироватки має ряд недоліків:

1. для більшості клітин сироватка не є фізіологічною рідиною, з якою вони контактували у початковій тканині. Такий контакт міг здійснюватися, але у процесах загоєння ран й утворення кров’яних згустків; при цьому сироватка викликає ріст фібробластів, але гальмує ріст епідермальних кератиноцитів;

2. часто недооцінюється можливість цитотоксичності сироватки. Окрім селективних інгібіторів, бактерійних токсинів і ліпідів сироватка може містити поліаміноксидазу. Фермент діє на поліаміни, що є продуктами секреції швидко проліферуючих клітин, в результаті чого утворюються цитотоксичні поліаміноальдегіди. Ембріональна сироватка великої рогатої худоби й сироватка вагітних жінок на відміну від кінської сироватки містять відносно багато цього ферменту;

3. значних зміни властивостей сироватки від партії до партії роблять необхідним ретельний скринінг сироваток, що займає багато часу і дорого обходиться;

4. сироватки можуть містити недостатню кількість специфічних для даних клітин ростових факторів, що призводить до необхідності додавання цих факторів до культур клітин.

Можливі недоліки використання безсироваткових середовищ:

1. використання таких середовищ дає в багатьох випадках велику економію, але необхідність додавання у середовище гормонів й ростових факторів може зробити безсироваткове середовище таку д коштовну, як і середовище з сироваткою;

2. безсироваткове середовище часто буває придатним тільки для одного типу клітин, так що при роботі з декількома лініями може виникнути необхідність у різних варіантах безсироваткових середовищ.

Безсироваткове середовище

Існують дві головні причини використання безсироваткових середовищ при роботі з великою кількістю клітин:

1. необхідність уникнути присутності стороннього білку, від якого інакше доведеться очищати отримуваний продукт;

2. висока вартість ембріональної сироватки великої рогатої худоби.

Нині дослідження по заміщенню сироватки в культурах клітин розвиваються по трьох різних напрямах:

1. Аналітичний підхід. Виділення і ідентифікація сироваткових факторів, що необхідні для виживання і зростання клітин. Це надзвичайно трудомістке і часто безперспективне завдання, оскільки більшість гормональних факторів діють синергічно і є присутнім у сироватці в мінімальних кількостях.

2. Синтетичний підхід Сато разом з співробітниками. Додавання в основне поживне середовище різних комбінацій ростових факторів, які виконують функцію сироватки: специфічних та неспецифічних для клітин гормонів (включно з мітагенами), транспортних білків та факторів прикріплення й розпластання.

3. Метод, який запропонований Хемом разом з співробітниками. Метод заснований на поступовому зниженні концентрації сироватки до зупинки клітинної проліферації. Потім концентрація кожного компонента поживного середовища(вітамінів, амінокислот, гормонів та ін.) підбирається так, щоб розмноження клітин поновилося.

Загальні правила та застереження:

1) Повинна бути впевненість у тому, що у процесі приготування середовища та у процесі роботи з ним, не виникне втрати або інактивації незамінних поживних речовин та ростових факторів:

а) йони Fe²⁺ можуть окислюватися до Fe³⁺, преципітируювати та втрачатися при стерилізації фільтруванням. Тому додавати Fe²⁺ потрібно безпосередньо перед стерилізацією середовища.

б) змішування концентрованих розчинів з Са²⁺ й РО₄^3- може призвести до утворення осаду Са₃(РО₄)₂.

в) високі концентрації цистеїну можуть ін активувати інсулін, так що концентрація цистеїну повинна бути знижена до 10 мкМ. При неможливості слід додати інший відновлюваючий агент (наприклад, дитіотреітол або тіогліцерин).

г) мікро емульсії й ліпосоми завжди слід готувати перед вживанням. Ненасичені жирні кислоти можуть окислюватися; мікроемульсії і ліпосоми можуть частково втрачатися при стерилізації середовища фільтруванням. Необхідно перевіряти цитотоксичніть стабілізаторів ліпосом.

2) Клітини у безбілковому середовищі більш чутливі до стресових дій культивування, ніж клітини в середовищі з сироваткою. Тому треба частіше пересіювати клітини, які ростуть у безсироватковому середовищі.

Контрольні питання:

1. Які функції сироватки?

2. Назвати переваги та недоліки сироваткових середовищ

3. Перелічити основні компоненти поживних середовищ.

4. Яке значення гормонів для культури тваринних клітин?

5. Перелічити підходи заміщення середовищ.

 

Лабораторна робота № 7,8