Тема: Поживні середовища, які використовують при клітинному клонуванні тварин.

Мета: ознайомитися з видами поживних середовищ для культивування тканин та клітин тварин.

 

Порядок виконання роботи

Вказати особливості складання поживних середовищ для культивування рослинних та тваринних клітин.

Після витягання клітин з тканини чи організму та переміщення їх у культуру культуральне середовище повинне забезпечувати усі зовнішні умови, які клітини мали in vivo. Тільки у цьому випадку можливі виживання клітин, їх проліферація та диференційовка. Позаклітинне середовище повинно володіти всіма необхідними для виживання й росту властивостями, тобто забезпечувати клітини поживними та гормональними факторами. Серед біологічних середовищ, які виявилися придатними для культивування клітин поза організму, найбільше розповсюдження отримала сироватка. Хоча вже частково виявлені потреби клітин, для задоволення яких складають складні хімічно визначені середовища, додавання 5 – 20 % сироватки було і залишається необхідним для підтримки оптимального росту клітин. Часто по різним причинам буває необхідно позбавитися від неідентифікованих компонентів сироватки, тобто отримати хімічно відоме середовище.

Фактори росту. Більшість ростових факторів присутні в сироватці у концентрації кількох нанограмів на мілілітр та нижче. Деякі з цих факторів специфічні для клітин на певній стадії диференціювання, як, наприклад, гематопоетичний фактор росту(колонієстимулюючий фактор). Деякі фактори діють синергетично, а дія ряду факторів не обмежена яким-небудь одним типом клітин. Один і той же тип клітин може бути стимульований різними ростовими факторами. До теперішнього часу фізіологічна роль усіх цих багато чисельних факторів не з’ясована.

Гормони. Серед гормонів найбільш важливим для забезпечення росту майже всіх типів клітин у культурі виявляється інсулін. Цей гормон звичайно додають в культуру у відносно високій концентрації, оскільки він швидко розпадається, а також інактивується цистеїном. Глюкокортикоїди (гідрокортизон, дексаметазон) можуть стимулювати або пригнічувати ріст клітин у культурі в залежності від типу клітин та їх щільності. Глюкокортикоїди впливають на проліферацію клітин, змінюючи їх чутливість до факторів росту. Деякі лінії клітин потребують інших стероїдних гормонів (естрадіол, тестостерон, прогестерон). Гормони щитовидної залози (головним чином триіодтиронін) виявляються активними у підтримці росту деяких кліткових ліній.

Фактори прикріплення й розпластання. Однією з головних функцій сироватки є забезпечення клітин факторами прикріплення та розпластання, незамінними компонентами позаклітинного матриксу.

Більшість клітин ссавців, перед тим як почати проліферацію та утворювати клітинний монослой, повинні прикріпитися до субстрату та розпластатися в ньому.

Ліпіди. Сироватка є багатим джерелом різних ліпідів, необхідних клітинам, що культивуються, для виживання й росту. Лінії клітин розрізняються за необхідністю у незамінних жирних кислотах, фосфоліпідах, лецитині та холестерині. Так, наприклад, оптимальний баланс жирних кислот та холестерину варіює в значних межах для різних ліній кровотворних клітин й для однієї і тієї ж лінії на різних стадіях дозрівання.

Мінеральні речовини. Роль присутніх у сироватці неорганічних мікроелементів (Cu, Zn, Co, Mn, Mo, Va, Se) з’ясована не повністю, але багато з них можуть бути факторами ферментів. Так, наприклад, йони SeO₃^2- потрібні для активації ряду ферментів метаболічної детоксикації. Йони селена можуть брати участь у інактивації вільних радикалів.

Сироватка являє собою надзвичайно складну суміш багатьох дрібних та крупних молекул, здатних як викликати, так і гальмувати ріст клітин. Деякі компоненти сироватки, які здатні підтримувати виживання і ріст багатьох клітин ссавців у культурі, перераховані у таблиці.

До головних функцій сироватки відносять:

1. забезпечення гормональними факторами, які стимулюють ріст клітин та їх функції;

2. забезпечення факторами прикріплення й розпластання клітин (створення біоматриксу);

3. забезпечення транспортними білками, які переносять гормони, мінеральні речовини, ліпіди та ін.

 

Таблиця 6.1 – Головні компоненти сироватки, необхідні для виживання й росту клітин.

 

Компонент	Основні функції
Білки
Альбумін	Переносить ліпіди, гормони, мінеральні речовини. Забезпечує осмотичний тиск, буферну ємність
Фібронектин	Викликає прикріплення клітин до субстрату
α2-Макроглобулін	Пригнічує активність трипсину
Фетуїн	Полегшує прикріплення клітин
Трансферин	Зв’язує Fe^2+
Поліпептиди й фактори росту
Інсулін-подібні фактори росту І та ІІ (ІФР)	Мітогени
Інсулін	Збільшує накопичення глюкози та амінокислот клітинами
Соматомедіни А і С	Мітогени
Активність, яка стимулює розмноження (АСР)	Мітоген
Фактор росту, що синтезується тромбоцитами (ЧРСТ)	Мітогени для фібробластів, гладко-м'язових клітин та ін
Фактор росту епідермісу (ЧРЕ)	Мітоген
Фактор росту фібробластів (ЧРФ)	Мітоген
Фактор росту ендотелію	Мітоген
Фактор росту з ока	Мітоген
Пептиди
Глутатіон	Окислювально-відновні реакції
Інші гормони
Кортизол (гідрокортизон)	Викликає прикріплення клітин, індукує клітинну диференційовку
Естрогени, андрогени	Мітогени
Гормони щитовидної залози (тироксин, триіодтіронин)	Дихання, енергетичний метаболізм. Викликають ріст та диференційовку різних клітин
Ліпіди
Лінолева кислота	Біосинтез мембран
Простагландіни
Холестерин	Біосинтез мембран
Метаболіти
Амінокислоти
α-Кето-кислоти (піруват)
Поліаміни	Проліферація клітин
Мінеральні речовини
Fe^2+, Zn^2+, Cu^2+, Mn^2+, SeO3^2+, Co^2+, Vo3^-, Mo7O24^6-	Різні функції, у тому числі активація ферментів

 

Можливі переваги використання безсироваткових середовищ та середовищ з низьким вмістом сироватки. Використання таких середовищ обумовлює наступні переваги:

1. поліпшення відтворюваності результатів дослідів на страхованих культурах внаслідок більшої стабільності складу середовища (властивості сироватки можуть змінюватися від партії до партії);

2. зниження ризику зараження культури вірусами, грибами, мікоплазмою;

3. зниження вартості(особливо у разі ембріональної сироватки великої рогатої худоби);

4. полегшення очищення продуктів клітинного метаболізму;

5. зниження впливу додаткових білків на результати біологічних досліджень;

6. відсутність цитотоксичності сироватки;

7. відвертання багатошарового зростання фібробластів в первинній культурі;

8. селективне культивування диференційованих і функціонально таких, що розрізняються типів клітин з гетерогенної популяції первинної культури без переважної стимуляції окремих субпопуляцій.