Тема: аналіз культивування рослинних об’єктів in VItro.

Мета: проаналізувати результати культивування рослинних об’єктів на поживному середовищі.

 

Порядок виконання роботи

Ознайомитися з результатами культивування наступних типів рослинних об’єктів.

1. Калуси, отримані в культурі пиляків кукурудзи. Підтримуються близько 8-місяців на середовищі MS, яке вміщує 1 мг/л 2,4- дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-Д). Калуси мають різну морфологічну структуру, колір, структуру поверхні.

2. Калуси, отримані в культурі незрілих зародків кукурудзи, підтримуються більше року на середовищі MS, яке вміщує 2,4-Д, пролін, AgNO_3. Калуси безкольорові, м’які, здатні до регенерації.

3. Рослини-регенерати в культурі калусної тканини кукурудзи. Утворення зелених проростків і коренів спостерігається при трансплантації калуса на безгормональне середовище.

4. Клітинні культури кукурудзи.

5. Процес мікроклонального розмноження можна спостерігати на прикладі:

а) культивування сегментів листка фіалки на середовищі MS з 0,1 мг/л нафтилоцтової кислоти (НОК), 0,5 мг/л 6-бензиламінопурину (6-БАП) для отримання меристематичних і калусних зон поблизу поверхні поранення і мікророзеток на їх основі;

б) культивування мікророзеток на середовищі MS з 0,2 мг/л НОК, 0,1 мг/л 6-БАП і 0,1 мг/л ГК₃ для росту мікро розеток;

в) культивування мікро розеток на без гормональному середовищі MS для утворення кореневої системи. Коефіцієнт розмноження Saunpaulia sp. В культурі in vitro складає 1:400 – 1:600.

6. Результати роботи оформити у вигляді таблиці.

 

Культура	Мета культивування	Експлантат	Середовище	Дата аналізу	Результати візуальних спостережень за культивуванням
Трансплантат	Умови культивування
1.Кукурудза   2.	Отримання калусної тканини з пилкових зерен для отримання гаплоїдів	Пиляк	MS+1мг/л 2,4-Д, 27 ^0С, темрява

 

 

Контрольні питання:

1. Які типи калусної тканини існують?

2. Як утворюються рослини-регенеранти в культурі калусної тканини?

3. Як відбувається ініціація та підтримання клітинних культур рослин?

4. Охарактеризуйте етапи мікроклонального розмноження рослин.

 

БІОТЕХНОЛОГІЯ ТВАРИН

Лабораторна робота № 5

Тема: Поняття про тканинне культивування

Мета: ознайомитися з типами тканин та клітин тварин для культивування

Порядок виконання роботи

Визначити особливості тканинного клонування рослинних та тваринних клітин, та записати у вигляді таблиці.

Культура клітин (клітинна культура).

Культура вже роз'єднаних клітин. В залежності від співвідношення з підтримуючим субстратом розрізнюють два види культур клітин: одношарові та суспензійні.

Типи тканин та клітин. Список типів клітин, що можна культивувати дуже великий. Це елементи сполучної тканини (фібробласти), кістки і хрящі, сердечні і гладкі м'язи, епітеліальні тканини, клітини нервової системи, ендокринні клітини.

Для того, щоб клітини проліферували (проліферація – це розростання клітини шляхом розмноження), вони повинні походити скоріше від недиференційованих клітин-попередників, ніж від повністю диференційованих клітин, у яких є здібність до проліферації у нормі втрачається. Однак, популяція не обов’язково повинна бути гомогенною й володіти фіксованим фенотипом. Деякі культури, наприклад кератиноцити епідермісу, містять стволові клітини, клітини-попередники та кератинизовані лускаті клітини. В такій культурі відбуваються постійні оновлення за рахунок стволових клітин, проліферація та дозрівання клітин-попередників й термінальне необоротне диференціювання, яке супроводжується «злущуванням» лускатих клітин у культуральне середовище. Культури інших клітин, наприклад, фібробластів, являють собою відносно однорідну популяцію проліферуючих клітин при низькій щільності монослою та однорідну популяцію більш диференційованих клітин при високій щільності монослою. Ця популяція фіброцит-подібних клітин при високій щільності монослою здатна до повернення в клітинний цикл у результаті трипсинізації, яка знижує щільність клітин у монослої, що призводить до появи вільного «краю» монослою.

Диференційовка та проліферація клітин регулюється не тільки щільністю монослою, а й поживними факторами середовища (сироватка, йони Са ²⁺, гормонами, взаємодією з позаклітинним матриксом.

Культури, які отримані з ембріональних тканин, характеризуються кращою виживаністю та більш активним ростом у порівнянні з культурами з відповідних дорослих тканин. Це відображає більш низький рівень спеціалізації та наявність клітин-попередників, які реплікуються, або стволових клітин у ембріонах. Дорослі тканини володіють, як правило, зниженим проліферативним пулом і вищим вмістом спеціалізованих клітин, що не діляться, які часто асоціюються з більш структурованим та слабо дезагрегуючим позаклітинним матриксом.

Клітини мезодермального походження (фібробласти, ендотелій, міобласти) легше культивувати, ніж епітеліальні клітини, нейрони та клітини ендокринних тканин. Завдяки використанню цих культур було показано, що сироватка здатна пригнічувати ріст культури та сприяти диференціюванню клітин.

Нормальні тканини, як правило, дають початок культурам з обмеженим часом життя, тоді як культури клітин, отримані з пухлин, здатні проліферувати необмежено довгий час. Відомо декілька ліній необмежено проліферуючих клітин, які не щепляться при введенні тваринам, тобто не є пухлеродними.

Нормальні клітини ростуть звичайно як недиференційовані стволові клітини або клітини-попередники, та настання диференціювання у такій культурі супроводжується часто припиненням проліферації клітин. Деякі нормальні клітини, наприклад, фіброцити та клітини ендотелію, здатні диференціюватися, потім дедиференціюватися, відновлювати проліферацію та знов диференціюватися. Інші – наприклад, ороговілий епітелій і багато кровотворних клітин – після ініціації диференційовки нездатні до відновлення проліферації.

У культурах клітин, отриманих з пухлин можлива часткова диференційовка при збереженні здатності до проліферації.

Головним фактором при виборі тканини чи лінії клітин для подальшого дослідження являється природа процесу, який вивчатиметься на цих клітинах. Вивчення таких загальних клітинних процесів, як синтез ДНК, проникність мембран або визначення цитотоксичності може бути проведене на будь-яких типах клітин. Дослідження спеціалізованих клітинних функцій, таких як утворення міотрубок, синтез антитіл або регуляція ферментів циклу сечовини, вимагає використання особливих типів клітин, в яких відбувається експресія цих функцій.

Після посіву клітин у флакон вони входять до лаг-періоду тривалістю 2 – 24 год., який змінюється періодом експоненціального зросту. У кінці цього періоду клітини досягають щільного монослою й входять у період повільного зросту або покою. Ці фази характерні для усіх кліткових ліній та дозволяють отримати відтворні характеристики кліткових ліній: тривалість лаг-періоду, час подвоєння популяції в середині експоненціальної фази та щільність клітин у монослою у період покою. Відтворність цих характеристик можлива тільки при постійних умовах культивування.

Поведінка клітин та їх біохімічні властивості помітно відрізняються на різних фазах зросту культури, тому важливо контролювати стадію циклу зросту, на якій у культури додаються різні препарати або реагенти чи відбувається збір клітин для пересіву. Форма кривої росту дозволяє також отримати інформацію про репродуктивний потенціал культури.

Деякі клітини, що швидко діляться, наприклад постійні лінії клітин, потребують зміни середовища після 3 – 4 діб культивування. На необхідність зміни середовища показує значення рН нижче 7,0.

 

 

Схема 1. Варіанти первинної культури. Різні шляхи отримання лінії клітин; в центрі та зліва – шляхом механічної дезагрегації, праворуч – шляхом ферментативної дезагрегації. Експлантати можна переносити, щоб стимулювати подальший ріст клітин експлантата, в той час як, клітини, що вийшли з експлантата, можна субкультивувати для отримання лінії клітин.

Контрольні питання

1. Які типи клітин можна культивувати?

2. Які повинні бути клітини-попередники?

3. Яке значення сироватки?

4. Який головний фактор при виборі тканин?

5. Які тканини володіють зниженою проліферацією?

 

 

Лабораторна робота № 6