Тема: Приготування і стерилізація поживних середовищ.

Мета: освоїти методики приготування та стерилізації поживних середовищ.

Матеріали та устаткування: ваги, автоклав, рН-метр, компоненти поживних середовищ, лабораторний вимірювальний посуд, культуральні посудини для розливу поживних середовищ.

 

Компоненти середовища для вирощування калусних і клітинних культур рослин можна розділити на наступні групи.

1. Основні неорганічні поживні речовини (макросолі та мікросолі).

2. Джерело заліза.

3. Вітаміни.

4. Регулятори росту рослин.

5. Джерела вуглецю.

6. Інші компоненти.

Для приготування агаризованих середовищ додають агар до кінцевої концентрації 6-10 г/л.

Для приготування розчинів використовують хімічні реактиви не нижче марки ХЧ та дистильовану воду.

Приготування середовищ для культивування з окремих компонентів здійснюють наступним чином.

1. Готують маточні розчини основних неорганічних солей, мікроелементів, вітамінів і регуляторів росту рослин. Маточні розчини макросолей виготовляють у 20-катній концентрації, мікросолей та інших речовин - у 100-кратній концентрації. Маточні розчини неорганічних речовин можуть зберігатися протягом місяця при температурі +4⁰, вітаміни слід зберігати порціями у заморожуваному стані при температурі -20⁰.

2. Для виготовлення 1л рідкого середовища у склянку об’ємом 1л за допомогою мірного посуду переносять необхідний об’єм кожного з вихідних розчинів.

3. Зважують сухі компоненти - мезоінозит, сахарозу тощо, повністю розчиняють їх та додають до інших компонентів.

4. Дистильованою водою доводять об’єм середовища до 950 мл.

5. Доводять рН середовища до 5,6-5,9 за допомогою 0,1 N NaOH.

6. Переносять середовище у мірний циліндр об’ємом 1л і доводять об’єм до мітки дистильованого водою, середовище добре перемішують.

7. Розливають середовище порціями (по 100 мл) в чисті конічні колби об’ємом 250 мл, закупорюють їх ватними пробками, накривають ковпачками з паперу, підписують колби.

8. Автоклавують середовище 25 хвилин при тиску 0,7-0,8 атм.

Для приготування агаризованих середовищ наважку агару в рідке середовище вносять перед автоклавуванням.

 

Порядок виконання роботи

 

1. Приготувати 1л поживного середовища Мурасіге-Скуга з маточних розчинів, розлити його в культуральні посудини, простерилізувати.

 

 

Таблиця 2.1 – Склад середовища Мурасіге-Скуга

 

на 1л середовища	на 250мл середовища
Компонент	Об’єм маточного розчину/маса	Від-міт-ки	Компонент	Об’єм маточного розчину/маса	Від-міт-ки
Макросолі MS	50 мл		Макросолі MS	12,5 мл
Мікросолі MS	1 мл		Мікросолі MS	0,25 мл
Fe –хелат	5 мл		Fe –хелат	1,25 мл
Тіамін - HCl	0,1 мг		Тіамін - HCL	0,025 мг
Нікотинова кислота	0,5 мг		Нікотинова кислота	0,125 мг
Гліцин	2 мг		Гліцин	0,5 мг
2,4-дихлорфеноксі-оцтова кислота	1мг		2,4-дихлорфеноксі-оцтова кислота	0,25 мг
Меноінозит	100 мг		Меноінозит	25 мг
Сахароза	30 г		Сахароза	7,5 г
Агар	8 г		Агар	2 г
рН	5,8		рН	5,8

 

2. Результати роботи оформити у вигляді таблиці.

 

№	Реєстрація приготування поживного середовища	Значення
	Дата виготовлення середовища
	Найменування середовища
	Об’єм приготовленого середовища
	Вихідне значення рН середовища
	Кінцеве значення рН середовища
	Кількість і концентрація NaOH, яке використовується для отримання кінцевого значення рН середовища
	Кількість колб об’ємом мл, в які розлите середовище
	Режим автоклавування

 

 

Контрольні питання:

1. Охарактеризувати основні групи речовин, які входять до поживних середовищ.

2. Як готувати та зберігати маточні розчини?

3. Наведіть порядок приготування поживного середовища.

4. Як приготувати агаризоване поживне середовище?

5. При якому режимі ведеться автоклавування поживних середовищ?

6. Який обсяг поживного середовища слід наливати в посудину для автоклавування?

Лабораторна робота №3.

Тема: Стерилізація і посадка експлантатів на штучне поживне середовище.

Мета: засвоїти методичні прийоми стерилізації та експлантації рослинних об’єктів на поживне середовище.

Матеріали та устаткування: стерильне поживне середовище, ламінар-бокс, стерилізуючий розчин, колбі з стерильною дистильованою водою, хімічний посуд, марля, вата, спирт 96⁰, спиртовки, сірники, чашки Петрі, плівка для чашок Петрі.

 

Освоєння прийомів стерилізації і посадки експлантатів в умовах ламінар-бокса на штучне поживне середовище проводиться на прикладі посадки сегментів листків тютюну на поживне середовище MS +1мг/л 2,4-дихлорфеноксіоцтової для отримання калусної тканини.

Культури калусів можуть бути отримані з багатьох органів рослин (коренів, пагонів, листків) або з певних типів клітин (ендосперм). Вибір експлантату в значеній мірі залежить від поставлених завдань дослідження. Приступати до отримання калусних культур можна після вибору експлантату і підбору поживного середовища. При цьому слід перевірити, чи відібраний експлантат знаходиться у належному біологічному стані та стадії розвитку для отримання калусних культур. Молоді тканини більш придатні для цієї мети, ніж зрілі. Розмір і форма вихідного експлантату також мають певний вплив на проліферацію калусу.

Серед агентів, які використовують для стерилізації, найчастіше застосовують гіпохлорит Ca або Na (профільтрований насичений розчин). До стерилізуючого розчину необхідно додати декілька крапель препарату Tween-80 або іншого детергенту для покращення змочуваності та рівномірного розподілення розчину на поверхні тканини. Після стерилізації матеріал необхідно ретельно промити 5 разів стерильною дистильованою водою і приступити до експлантації його на штучне поживне середовище.

 

Порядок виконання роботи

 

1. Підготувати необхідний стерильний посуд, стерильне поживне середовище, стерилізуючий розчин хлорного вапна, стерильну дистильовану воду, необхідні інструменти.

2. Стерильне поживне середовище розігріти до рідкого стану. Всі подальші операції виконувати в стерильних умовах ламінар-боксу!

3. Стерильно розлити поживне середовище в чашки Петрі.

4. Листки опустити в стерилізуючий розчин на 7 хвилин, потім стерильно перенести в посудину зі стерильною дистильованою водою, промити 5 разів, змінюючи стерильну воду.

5. Пінцет і скальпель змочити у спирті і прокалити у полум’ї.

6. Стерильно розрізати листок на сегменти і помістити їх на поверхню поживного середовища.

7. Запечатати чашки Петрі плівкою, підписати.

8. Перенести чашки Петрі в культуральну кімнату із заданим режимом культивування.

9. Результати роботи оформити у вигляді таблиці.

 

№	Запис	Зміст
	Мета експерименту	Отримання калусної тканини
	Вид рослини	Nicotiana tabacum
	Дата експлантації на поживне середовище
	Назва поживного середовища
	Експлантат (тип, розмір)
	Режим стерилізації експлантату
	Щільність експлантації на поживне середовище, тип культуральної посудини
	Умови культивування

 

Контрольні питання:

1. Які експлантати краще використовувати для отримання калусної тканини?

2. Які режими стерилізації експлантатів використовують в біотехнології рослин?

3. З якою метою експлантати після стерилізації промивають стерильною дистильованою водою?

4. З якою метою до стерилізуючого розчину додають Tween-80?

 

Лабораторна робота №4.