Цитогенетический анализ каллусных клеток

 

Цель работы: ознакомиться с цитогенетическим анализом каллусных клеток, в частности, с основными характеристиками суспензионной культуры; обратить внимание на особенности данного анализа, уметь проводить его.

 

Теоретические основы

Для работы с клеточными суспензиями необходимо знать их характеристики: жизнеспособность, плотность клеток в суспензионной культуре, степень агрегированности, скорость роста.

Жизнеспособность клеток опредляют по их окрашиванию красителем (метиленовым синим). Живые клетки не окрашиваются красителем вследствие непроницаемости для него клеточных мембран. В мертвые клетки краситель легко проникает, и они окрашиваются в синий цвет. Существует правило: если более 50 % клеток в агрегате не окрашивается, он считается живым.

Одним из основных показателей, характеризующих состояние клеточной суспензии, служит плотность клеточной популяции. Число клеток определяют в счетной камере Фукса-Розенталя под микросокопом после мацерации (разделения клеток). В качестве мацерирующего вещества применяют хромовую кислоту (10...20 %-ную), которая гидролизует срединные пластинки, соединяющие клетки.

Хорошо растущая суспензия имеет, как и каллусная культура, S-образную кривую роста. Различают три фазы ростового цикла суспензии:

· лаг-фаза (2-3 сут);

· фаза экспоненциального роста (2-10 сут);

· стационарная фаза (10-15 сут).

Продолжительность фаз зависит от вида растений и первичного экспланта, из которого получена каллусная культура (и затем суспензия), начального количества клеток (первичного инокулята), условий выращивания. Обычно длительность пассажа составляет 14-16 дней. При этом плотность возрастает от 5^.10⁴ до 5^.10⁶ кл/мл. Суспензию для субкультивирования берут в конце экспоненциальной фазы. Увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы – основные критерии роста суспензионных культур.

Качество суспензии зависит от степени агрегированности ее клеток. Агрегаты не должны содержать более 10-12 клеток. Поэтому, чтобы удалить крупные агрегаты, суспензию фильтруют через марлевые, нейлоновые или металлические фильтры. Одновременно это дает возможность освободиться от остатков экспланта или плотных кусков каллусной ткани. Суспензионная культуры различается по степени агрегированности. Она бывает мелкоагрегированная, среднеагрегированная, крупноагрегированная.

Объем выборки должен составлять не менее 1000 клеток. Подсчет клеток затрудняется, если в суспензии преобладает фракция агрегатов. В таких случаях к 1 объему культуры добавляют 2 объема 8 % оксида хрома и нагревают до 70⁰С в течение 2-15 минут. После охлаждения культуру встряхивают, чтобы распались агрегаты. Для разрушения агрегатов в суспензию добавляют пектиназу – 0,25 % объема.

Плотность суспензии можно определить и по соотношению объема биомассы к общему объему суспензии. Измеряют средний объем клетки и получают число клеток в 1 мл суспензии.

 

Определение степени агрегированности и жизнеспособности
клеток

 

Приборы и материалы: колбы с суспензионной культурой, стерильные пипетки, резиновая груша, краситель – метиленовый синий, предметное стекло, стеклянные палочки, камера Фукса-Розенталя, микросокоп.

 

Ход выполнения работы:

 

Для подсчета жизнеспособности клеток на предметное стекло наносят каплю суспензии, рядом – каплю красителя. Смешивают стеклянной палочкой. Смесь переносят в камеру Фукса-Розенталя (гемоцитомер).

Камеру Фукса-Розенталя и покровное стекло предварительно моют хромпиком, а затем высушивают. Притирают покровное стекло к камере до появления колец Ньютона. Пипеткой с узким носиком набирают суспензию клеток и подносят к краю покровного стекла, при этом жидкость заполняет весь объем камеры.

Под микросокопом подсчитывают число живых и метрвых клеток; одиночных клеток, мелких и крупных агрегатов; общее число клеток. Подсчет клеток осуществляют в пяти больших квадратах (в четырех по диагонали и в одном в любом верхнем или нижнем углу сетки). Плотность суспензии, то есть число клеток в 1 мл рассчитывают по формуле:

М´n´1000

Х=, где Х – число клеток в мл,

3,2 М – среднее число клеток в камере,

n – кратность разведения.

Результаты записывают в таблицу, выполненную по форме:

Характеристика суспензионной культуры

Жизнеспособность, %	Степень агрегированности	Плотность суспензии, кл/мл

 

Показатели снимают через день в процессе всего культивирования и по ним строят S-образную кривую роста.

 

Высев суспензионной культуры на твердую агаризованную питательную среду (метод Плейтинга)

 

Материалы и оборудование: суспензионная культура, стерильные чашки Петри, цилиндр, среда для роста клеточной суспензии с двойным содержанием агара (1,2-1,4 %).

 

Ход выполнения работы:

Для проведения работ по клеточной селекции мелкоагрегированную суспензионную культуру высевают на агаризованную питательную среду. При этом одиночные клетки и клетки, входящие в состав мелких агрегатов, делятся и образуется каллусная ткань, из которой в дальнейшем формируются растения-регенеранты.

Клеточную суспензию переливают в стерильный цилиндр и оставляют на 5 минут. Пипеткой отбирают 5 мл верхней фракции суспензии (она обогащена одиночными клетками) и смешивают в стерильном цилиндре с 5 мл теплой (36 ^оС) питательной среды для роста каллусной ткани. Эта среда должна содержать двойное количество агара, т.е. 1,4 %. Содержимое цилиндра быстро разливают в чашки Петри, дают остыть, закрывают крышками и парафилмом.

Через 3-5 недель подсчитывают колонии клеток диаметром более 1 мм. Эффективность высева, %, рассчитывают по формуле: