Приготовление маточных растворов для питательной среды Мурасиге-Скуга (МС)

Материалы и оборудование: химические стаканы (на 50, 100, 250 мл), мерные цилиндры на 500 мл, автоклав, ламинар-бокс, весы аналитические до 500 г, весы торсионные до 100 мг,, колбы, штативы с пробирками, пипетки от 0,01 мл до 10 мл или дозаторы, хлорамин, стеклянные палочки, электроплитки, магнитные мешалки, дистиллированная вода, вата, 96 % этанол, химические реактивы: KNO₃, NH₄NO₃, NH₄H₂PO₄, MgSO₄^.7H₂O, CaCl₂^.2H₂O, KH₂PO₄, MnSO₄^.H₂O, KI, H₃BO₃, ZnSO₄, CuSO₄, Na₂MoO₄^.2H₂O, CoCl₂^.6H₂O, FeSO₄^.7 H₂O, Na₂ЭДТА, мезоинозит, тиамин- НСl, никотиновая кислота, пиридоксин- НСl, сахароза, ауксины, кинетины, индикаторная бумага, фильтровальная бумага.

Ход выполнения работы:

Маточные растворы солей готовят на дистиллированной воде. Каждую из макросолей растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, а затем сливают в колбу и объем доводят до 1 л, причем раствор MgSO₄^.7H₂O вливают последним без нагревания в охлажденную смесь, что предотвращает выпадение осадка. Соль CaCl₂ готовят и хранят отдельно. Хелат железа (раствор FeSO₄ и Na₂ЭДТА) готовят при нагревании и хранят отдельно. Каждую соль микроэлементов растворяют отдельно и сливают в общий стаканчик, а объем доводят до 100 мл. Полученные растворы макро- и микроэлементов сливают в колбы с притертой пробкой (хелат железа – в колбу из темного стекла), наклеивают этикетку и помещают в холодильник.

Для приготовления концентрированных растворов витаминов берут 10-кратные навески и растворяют их (каждый витамин в отдельности) в 10 мл воды; 1 мл содержит концентрацию витамина, необходимую для приготовления 1 л раствора по прописи Мурасиге-Скуга. Хранят растворы во флакончиках из под пенициллина в замороженном состоянии.

Растворы фитогормонов готовят следующим образом. Берут 10 мг вещества и растворяют: ауксин (2,4-Д, ИУК, НУК) в 0,5-2,0 мл этанола; цитокинины (кинетин, зеатин, БАП, 2 ip) в небольшом количестве 0,5 н НСl или КОН, абсцизовую кислоту (АБК) в 70 %-ном этаноле. Затем растворы подогревают (кроме АБК) и доливают водой до объема 100 мл (1 мл содержит 1 мг гормона). В холодильнике их можно хранить при температуре 4 ^оС не более 1 мес.

 

Контрольные вопросы:

 

1. Что является основой всех питательных сред для выращивания изолированных клеток и тканей.

2. Какие вещества входят в состав питательных сред и какую функцию они выполняют в культуре клеток и тканей in vitro?

3. Методика приготовления растворов солей питательных сред для культивирования клеткок растений.

4. Цитокинины и ауксины, состав, функции.

5. Витамины, входящие в состав питательных сред.

6. Какие органические добавки вносят в питательную среду?

Лабораторная работа № 4

 

Приготовление жидкой и агаризованной питательной среды Мурасиге-Скуга

Цель работы: ознакомиться с принципами составления питательных сред для культивирования клеток и тканей in vitro, освоить методику приготовления жидкой и агаризованной питательной среды Мурасиге-Скуга, а также других сред.

Материалы и оборудование: автоклав, ламинар-бокс, весы аналитические до 500 г, химические стаканы (на 50, 100, 250 мл), колбы, мерные цилиндры 500 мл, штативы с пробирками, пипетки от 0,01 мл до 10 мл, хлорамин, стеклянные палочки, электроплитки, дистиллированная вода, 96 % этанол, готовые маточные растворы макро – и микросолей, витаминов, фитогормонов, ауксины, кинетины, индикаторная бумага, фильтровальная бумага.

Теоретические основы

Культивирование изолированных клеток и тканей происходит на многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различны по составу, однако, в состав питательных сред обязательно входят следующие, необходимые растениям, группы веществ: микроэлементы, макроэлементы, углеводы, витамины и фитогормоны.

Успех в культивировании клеток, тканей и органов прежде всего определяется составом питательной среды. Культура клеток каждого вида растений и даже разных органов и тканей одного и того же вида требует питательной среды определенного состава. Почти любой исследователь пытается разработать оптимальную среду для своего объекта, поэтому количество рецептов питательных сред с каждым годом все возрастает.

Питательные среды для культивирования содержат минеральные соли, углеводы, витамины, регуляторы роста, аминокислоты.

Выбор питательной среды определяется видом растения, которое вводится в культуру, а также задачами эксперимента. Если, в литературе не имеется необходимой информации, работу начинают с применения таких широко используемых питательных сред, как среда Мурасиге-Скуга, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга В₅, Уайта, а затем подбирают концентрации регуляторов роста и органических добавок. В таблице 3 приведены составы некоторых питательных сред. Эти среды оказались эффективными для культивирования in vitro различных видов как однодольных, так и двудольных растений.