Субкультивирование клеток и оценка роста

 

Цель работы: ознакомиться с основными фазами развития и роста каллусных клеток, дифференцировки, морфогенеза и регенерации. Исследовать влияние внешних и внутренних факторов на развитие каллусных клеток и целого растения.

 

Теоретические основы

В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный онтогенез: растут растяжением, дифференцируются и деградируют. Рост каллуса внешне отражает образная кривая. Ростовой цикл начинается с посадки экспланта на среду (начало кульвирования), а завершается в момент прекращения митозов (стационарная фаза).

В лагфазе (латентной фазе) клетки не делятся, не цвеличиваются в размере, имеют низкую метаболическую активность. В экспоненциальной фазе (фазе логарифмического роста) клетки активно делятся митозом. В ранней экспоненте увеличивается количество митохондрий (синтезируется АТФ), рибосом, всех видов РНК, синтезируются белки, активизируется метаболизм, интенсивно поглощается кислород. Поздняя экспонента или фаза латентного роста характеризуюется снижением удельной скорости роста, замедлением клеточного деления, увеличением среднего размера клеток за счет растяжения. В стационарной фазе размер клеток продолжает увеличиваться, а их деление прекращается. В поздней стационарной фазе (фазе деградации) за счет истощения среды клетки стареют и умирают.

Продолжительность ростового цикла каллусных клеток 21-28 дней. В процессе культивирования каллус пассируют (персаживают на свежую питательную среду) каждые 4-6 недель. Масса транспланта (фрагмента ткани, который пасируют на свежую питательную среду) составляет 60-100 мг на 20-40 мл среды.

Свежевыделенные культуры носят название «первичные» до начала пассирования или субкультивирования. Клетки первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются малым пролиферативным пулом, но в них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены, а также четко обнаруживается экспрессия ряда свойств, присущих данной ткани. Субкультивирование обеспечивает возможность продления существования культуры (в результате субкультивирования получают линии клеток), возможность клонирования, исследования и сохранения клеток, а также получения более однородных популяций. При этом во многих случаях субкультивирование приводит к потере, специализированных клеток и дифференцировочных признаков.

Основным преимуществом получения клеточных линий из первичных культур является наработка большого количества стабильного материала, пригодного для продолжительного использования.

Монослойная культура может быть перенесена во второй культуральный сосуд после диссоциации клеток монослоя трипсином и разведения. В случае субкультивирования суспензионных культур достаточно разведения. Диссоциация клеток монослойной культуры лучше всего достигается путем промывания монослоя фосфатным солевым буфером (ФСБ) или ФСБ с 1 мл ЭДТА и последующей инкубации с холодным раствором трипсина (0,25 % неочищенный или 0,01—0,05 % очищенный) в течение 30 с. После этого трипсин удаляют, Клетки дополнительно инкубируют в течение 15 мин. Затем клетки суспензируют в среде, определяют их количество и рассевают в новые флаконы.

Кривая роста

После посева клеток во флакон они входят в лаг-период продолжительностью 2—24 ч, сменяющийся периодом экспоненциального роста (логарифмическая фаза). В конце этого периода клетки достигают плотного монослоя и входят в период медленного роста или покоя (фаза плато). Эти фазы характерны для всех клеточных линий и позволяют получить воспроизводимые характеристики клеточных линии: продолжительность лаг-периода, время удвоения популяции в середине логарифмической фазы и насыщающую плотность клеток в монослое в фазе плато. Воспроизводимость этих характеристик возможна только при постоянстве условий культивирования.

Определение параметров ростового цикла важно для пассирования культуры и проведения экспериментов на культурах. Поведение и биохимические свойства клеток заметно различаются в разные фазы роста культуры, так что важно контролировать стадию ростового цикла, в которой в культуру добавляют различные препараты либо реагенты или проводить сбор клеток для пересева. Форма кривой роста позволяет также получить информацию о репродуктивной потенциале культуры. Не вызывает сомнения тот факт, что клональный анализ прост и позволяет сделать более однозначные и правильные вывода.

 

Материалы и оборудование: пробирки с каллусами, пробирки с питательной средой для культивирования каллусов, стерильные инструменты: пинцеты, препаровальная игла, скальпель, чашки Петри, 96 % спирт, дистиллированная вода.

 

Ход выполнения работы:

1. В асептических условиях извлечь каллусы из пробирок и поместить на стерильную поверхность (столик ламинар-бокса, обработанный 96 % спиртом и УФ-излучением), стерильной перпаровальной иглой выделить зоны меристематической активности (белые мелкие клетки).

2. Транспланты величиной 2-3 мм поместить на поверхность питательной среды (МС + ИУК- 0,5 мг/л + кинетин – 0,5 мг/л).

3. Результаты культивирования зарисовать через 2-4 недели, по результатам взвешиваний через 1,2,3.4 недели построить график роста каллуса.

Материалы и оборудование. Семена фасоли, 6% раствор хлорамина, стерильные инструменты: пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, чашки Петри с питательными средами для индукции каллусогенеза, стерильные чашки Петри, флаконы со спиртом и стерильной дистиллированной водой.

Ход выполнения работы:

1. Семена фасоли поместить в чашки Петри (по 15 штук в чашку), залить раствором хлорамина до полного погружения семян в жидкость и оставить на 20 минут.

2. Промыть семена стерильной дистиллированной водой 3 раза.

3.Стерильные семена залить стерильной водой и оставить для набухания на 24 часа.

4.Семена с разрушенной кожурой удалить, а жизнеспособные семена простерилизовать повторно 6% хлорамином 20 минут.

5. Промыть семена стерильной дистиллированной водой 3 раза.

6. Семена перенести в стерильные чашки Петри (по 5 штук в чашку).

7. Стерильным пинцетом придерживать семя, а стерильным скальпелем надрезать оболочку.

8. Стерильным скальпелем и препаровальной иглой изолировать корешки (2-3 мм) и перенести в чашки Петри со стерильной дистиллированной водой (по 15 штук в чашку).

Корешки стерильной препаровальной иглой поместить на поверхность агаризованной среды и слегка вдавить в агар для обеспечения хорошего контакта со средой (среда ШХ+10 мг/л п-ХФУК+2 мг/л 2,4Д+0,1 мг/л кинетина).

 

Контрольные вопросы:

1. Характеристика основных фаз ростового цикла каллуса.

2. Питательные среды, используемые для индукции каллусогенеза и культивирования клеток.

3. Пути морфогенеза in vitro.

4. Назвать основные способы культивирования каллусов.

5. Что такое дедифференциация и пролиферация клеток?

6. Чем характеризуются основные фазы ростового цикла каллуса?

7. Отличаются ли по морфологии каллусы различных видов растения?

8. Для каких целей используют культуру каллусов в биотехнологии, генетике и селекции?

9. Какие питательные среды используют для индукции каллусогенеза и культивирования каллусов?

 

 

Лабораторная работа № 9