Правила по технике безопасности при работе в лаборатории

Мамырбекова А.К.

 

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ

ПО ДИСЦИПЛИНЕ

«Биотехнология растений»

 

 

 

Шымкент – 2010 г.

Министерство образования и науки Республики Казахстан

южно-казахстанский государственный университет им. м.ауезова

Кафедра Биотехнологии

Мамырбекова А.К.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ

ПО ДИСЦИПЛИНЕ

«Биотехнология растений»

для студентов специальности 050701 –«Биотехнология»

 

Форма обучения: очная

 

Шымкент – 2010 г.

УДК 631. 52 (075.8)

ББК 41.3я73

М14

Составители: к.х.н. Мамырбекова А.К.

 

Методические указания к лабораторным занятиям по дисциплине «Биотехнология растений» для студентов специальности 050701 Биотехнология.- Шымкент: ЮКГУ им. М. Ауэзова, 2010.- 46 с.

 

 

Методические указания составлены в соответствии с требованиями учебного плана и программой дисциплины «Биотехнология растений» и включает все необходимые сведения по выполнению тем лабораторных работ курса. Методические указания предназначены для студентов специальности «Биотехнология».

 

Целью курса «Биотехнология растений» является ознакомление студентов с культивированием изолированных клеток, тканей, органов растений, применяющееся для изучения физиологических функций на клеточном и тканевом уровне. Студенты должны получить представление о принципах культивирования растительных клеток in vitro и о возможностях их использования в биотехнологии растений. Полученные знания студенты должны применить и закрепить при выполнении лабораторных работ.

 

 

Рецензенты: Кансеитов Т. -д.c-х.н., доцент кафедры Биотехнология

Туякбасов М.К.- к.б.н., с.н.с. ЮЗНИИЖиР

 

Рассмотрено и рекомендовано к печати заседанием кафедры Биотехнология (протокол №1 от «28» 08 2009 г.), методической комиссией агропромышленного факультета (протокол №1 от «29» 08 2009 г.).

 

 

Рекомендовано к изданию Учебно- методическим советом ЮКГУ им. М.Ауезова, протокол № от «» _________ 2010 г.

 

 

©Южно-Казахстанский государственный университет им. М. Ауезова, 2010.

 

 

Содержание

 

 

Введение
Правила по технике безопасности при работе в лаборатории
1. Организация биотехнологической лаборатории.
2. Методы стерилизации растительных объектов и оборудования при проведении работ с культурой изолированных клеток и тканей растений
3. Приготовление растворов солей (макро и микроэлементы), витаминов, фитогормонов.
4. Приготовление жидкой и агаризованной питательной среды Мурасиге-Скуга.
5. Подготовка растительного материала и изоляция эксплантов
6. Посадка и культивирование эксплантов на агаризованной среде.
7. Получение суспензионной культуры из каллуса.
8. Субкультивирование клеток и оценка роста.
9. Цитогенетический анализ каллусных клеток.

 

 

Введение

 

Биотехнология – это наука о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов для интенсификации производства или получения новых видов продуктов различного назначения. Научной основой биотехнологии являются принципы биохимии и микробиологии, клеточной и молекулярной биологии, генетики и селекции. Успехи, достигнутые в молекулярной биологии и генетике, создали предпосылки для управления процессами жизнедеятельности клеток и целого организма, что стало импульсом к развитию биотехнологии как науки на стыке разных дисциплин. Клеточная и тканевая биотехнология, а также генетическая инженерия растений – перспективные направления размножения, сохранения и увеличения генетического разнообразия растений.

В настоящее время биотехнология охватывает различные сферы человеческой деятельности. Благодаря возможностям биотехнологии можно существенно интенсифицировать производство, повысить эффективность использования природных ресурсов, решать проблемы, связанные с восполнением дефицита белка. Все направления исследований основаны на культивировании живых клеток различных организмов в условиях in vitro.

Биотехнология растений является одной из основных отраслей биотехнологии, основанная на использовании культивируемых in vitro клеток растений. Курс «Биотехнология растений» ставит целью освещение современного состояния знаний о биологии культивируемых растительных клеток как объекта биотехнологии и всех основных направлениях биотехнологии.

Цель практикума – подробно ознакомить студентов с конкретными объектами и с методами культивирования клеток, тканей и органов растений in vitro и факторах, регулирующих регенерацию растений, ознакомить студентов с методикой приготовления питательных сред для культивирования, культивированием клеток на различных средах, изучить морфологические и физиологические свойства клеток, привить им навыки работы в лаборатории биотехнологии.

 

 

Лабораторная работа № 1

Теоретические основы

 

Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также современное оборудование и высококачественные реактивы.

Главным условием функционирования лаборатории является соблюдение строгой стерильности во всех помещениях.

Лаборатория клеточной или генной инженерии включает в себя несколько помещений:

· лаборантскую комнату;

· моечную комнату;

· автоклавную комнату;

· комнату для проведения стерильной работы;

· световую комнату;

· комнату для обработки и хранения информации по исследованиям;

· адаптационную комнату;

· складская комната;

· раздевалку.

Лаборантская комната предназначена для приготовления питательных сред. В ней должны быть: холодная и горячая вода, лабораторные столы, шкафы для хранения чистой посуды и необходимых химических реактивов надлежащей степени чистоты (ХЧ, Ч, ЧДА), холодильники для хранения химических реактивов, аналитические (электронные) весы (точностью до 0,0001 г), электроплитки, дистиллятор, посуда химическая и биологическая для приготовления, хранения и стерилизации питательных сред, пипетки и микропипетки (на 0,01 … 10 мл), инструменты (шпатели, металлические пинцеты, скальпели, препаровальные иглы).

Моечная комната используется для мытья химической и биологической посуды. Оборудование моечной комнаты: мойки с горячей и холодной водой; дистиллированная вода; дистилляторы и бидистилляторы; сушильные шкафы с режимом работы для сушки посуды – до 100 – 130 ⁰С, для инструментов – до 170 ⁰С; шкафы для хранения чистой посуды и инструментов, емкости для хранения моющих средств, вытяжные шкафы с эксикаторами для хромпика (Н₂SO₄ 98% + K₂CrO₇). Моечную комнату желательно располагать изолированно, без контактирования со стерильными материалами, посудой, растениями.

Автоклавная комната предназначена для стерилизации питательных сред, инструментов и вспомогательных материалов. Оборудование помещения для стерилизации: автоклавы с режимом работы – давление 1-2 атмосферы и температура 120⁰С; сушильные шкафы для стерилизации посуды и инструментов сухим жаром, стеллажи для штативов с питательными средами; шкафы для хранения стерильных материалов. Данное помещение должно быть оборудовано приточно – вытяжной вентиляцией и иметь канализационный слив для отвода конденсата из автоклава.

Комната для проведения стерильной работы (бокс, операционная комната) предназначена для введения растительного материала в культуру in vitro и пересадки микрокультуры. Оборудование комнаты для инокуляции растительных эксплантов на питательные среды: ламинар – боксы, лабораторные столы, стеллажи, бактерицидные лампы, шкафы для материалов и оборудования.

Световая (культуральная комната) используется для выращивания растительных тканей в условиях in vitro. Оборудование культуральных комнат: световое оборудование – источники освещения со спектром близким к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), кондиционер для регуляции температуры (25± 2⁰С) и влажности воздуха (70%), стеллажи для штативов с культивируемым материалом; темновое отделение – с тем же оборудованием, исключая источники освещения. Для культивирования эксплантов на питательной среде желательно использовать термостаты или хладотермостаты, способные с высокой точностью поддерживать задаваемые режимы температуры и влажности воздуха, а также качалки.

Комната для обработки и хранения информации по исследованиям необходима для планирования, обработки и хранения данных экспериментов.

Адаптационная комната предназначена для адаптации микрорастений к почвенным или гидропонным условиям выращивания. Ее оборудуют стеллажами для ящиков (горшочков) с грунтом или гидропонными установками, а также дополнительным освещением.

Необходимый набор посуды, инструментов и материалов в биотехнологической лаборатории: мерные колбы, колбы Эрленмейера (конические), химические стаканы на 50,100,200,250,500 и 1 л, мерные цилиндры, чашки Петри, пробирки, бутылки, пипетки, стеклянные палочки, стеклянные и мерные фильтры, ланцеты (в том числе глазные, хирургические, анатомические), ножницы, пинцеты, ножы, бритвенные лезвия, препаровальные иглы, шпатели, бумага (оберточная, пергаментная, фильтровальная), фольга алюминиевая, вата.

Все работы с культурой клеток и тканей in vitro проводят в стерильных (асептических) условиях в стерильном боксе или ламинар – боксе, стерильными инструментами, в стерильной посуде, на стерильных питательных средах. В случае нарушения стерильности на средах хорошо развиваются микроорганизмы (грибы, бактерии), нарушающие состав среды и подавляющие рост растительных эксплантов.

Чаще всего для стерилизации помещений (боксов для пересадки тканей, культуральных комнат) используют ультрафиолетовое облучение в течение 0,5 – 2 часов (в зависимости от площади помещения). Работы в облученном помещении начинают через 15 – 20 минут после отключения бактерицидных ламп, так как под действием ультрафиолетового излучения двухатомный кислород воздуха становится трехатомным озоном – газом токсичным для человека. Для достижения максимальной стерильности перед обработкой УФ все поверхности тщательно отмываются моющими средствами, водой и растворами хлорсодержащих веществ, поверхности ламинар – бокса обрабатывают 96 % спиртом.

Посуду, халаты, вату, бумагу, дистиллированную воду, питательные среды стерилизуют в автоклавах под давлением пара 1 – 2 атмосферы и температурой 120 ⁰С в течение 20 – 60 минут, в зависимости от объема стерилизуемого материала.

Колбы, штативы со средой, вату, бумагу, халаты перед автоклавированием заворачивают в целлофановую бумагу, либо помещают в биксы.

Металлические инструменты автоклавировать нельзя, так как под действием пара образуется ржавчина. Поэтому их стерилизуют сухим жаром в термостатах с температурой 170 –250 ⁰С в течение 1 – 2 часа.

Лабораторная работа № 2

Теоретические основы

Одним из основных условий успешного культивирования изолированных органов, тканей, клеток и протопластов является соблюдение строгой стерильности, поскольку на искусственных питательных средах хорошо развиваются микроорганизмы, что представляет двойную опасность. Во-первых, в результате жизнедеятельности микроорганизмов может существенно измениться состав питательных сред. Во-вторых, изолированные от растения ткани, клетки и в особенности протопласты легко повреждаются микроорганизмами. Поэтому все опыты проводят в стерильных помещениях – боксах или ламинар-боксах. Стерилизуют бокс, инструменты, посуду, растительный материал, питательные среды, ватные пробки и все другие материалы.

Стерилизация ламинар-бокса. Ламинар-боксы предназначены для культивирования изолированных клеток, тканей и некоторых других работ, требующих стерильности, которая обеспечивается с помощью бактериальных воздушных фильтров. За 10-20 минут до начала работы ламинар-бокс облучают бактерицидными ультрафиолетовыми лампами. Предварительно в ламинар-боксе размещают спиртовую горелку, спички, фарфоровый стакан с 96 %-ным спиртом и колбы со стерильной водой, а при изолировании меристем – бинокулярную лампу. Внутреннюю поверхность ламинар-бокса, лупу, спиртовку обрабатывают 70 %-ным спиртом. Перед началом работы следует вымыть руки с мылом, протереть их спиртом, надеть стерильный халат, завязать волосы стерильной косынкой.

Ход выполнения работы.

1. Отобрать 30 здоровых зерновок пшеницы или тритикале.

2. В ламинар – бокс поместить семена в чашки Петри со стерилизующими растворами по 5 семян в каждую (6% хлорамин, 6% гипохлорит кальция, 96% спирт, сулема 0,1%, ампициллин 400 мг/л, вода). Время стерилизации подобрать экспериментально.

3. Отмыть семена от стерилизующих растворов дистиллированной автоклавированной водой.

4. Поместить семена для проращивания в стерильные чашки Петри на стерильную фильтровальную бумагу в небольшое количество стерильной дистиллированной воды. Чашки Петри закрыть и перенести в термостат для проращивания.

5. Результаты опыта зарисовать через неделю. Сделать выводы об эффективности стерилизующих растворов.

Контрольные вопросы:

1. Методы стерилизации растительных объектов.

2. Методы стерилизации оборудования.

3. Какую опасность представляет несоблюдение строго стерильности?

4. От чего зависит продолжительность стерилизации растительных объектов, привести примеры.

5. Стерилизующие растворы, рабочие концентрации, их приготовление.

 

Лабораторная работа № 3

 

Теоретические основы

Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.

Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде сульфатов; а также растворимых солей К⁺, Na⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺. Железо используется в виде хелатов [FeO₄ или Fe ₂ О₄ + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.

Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно – восстановительных ферментов (каталазы, пероксиазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К⁺, Na⁺, Ca⁺⁺, Сl^- , Н⁺ необходимы для регуляции рН среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).

В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20 – 60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, целлобиозой.

Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы – витамины группы В (В₁,В_6,В₁₂), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит.

Тиамин (В₁ ) входит в состав пируватдекарбоксилаза, участвует в превращения углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаминовой) является коферментом транскетолазы.

Пиродоксин (В₆) в виде фосфорнокислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.

Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно – акцепторную цепь Н⁺ (отнятие Н⁺ от молекул органических веществ).

Для управления процессом формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины и гиббереллины.

Ауксины: ИУК–β индолил–3–уксусная кислота, ИМК–индолил–3 – масляная кислота, НУК–α–нафтилуксусная кислота, 2,4–Д–2,4– дихлорфеноксиуксусная кислота.

Цитокинины: кинетин–6–фурфуриламинопурин, зеатин, NN– дифенилмочевина, 6 – БАП – 6 – бензиламинопурин, 2-изопентениладенин (2 ip).

Гиббереллины: гиббереловая кислота.

В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10 – 15 % от общего объема среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6 – ти замещенные аминопурины) и NN – дифенилмочевину.

В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений – регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки помещают специальные мостики- поддержки из фильтрованной бумаги или синтетических пористых материалов.

Агаризованные среды готовят на основе агар – агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при рН 5,6 – 6 иногда в качестве уплотнителя и заменителя используют полиакриламидные гели (биогели) Р₁₀ и Р₁₀₀.

Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с при тертыми пробками при 0… + 4°С; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при –20°С в небольших по 5 – 10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).

Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10 – 40 раз, микросолей – в 100 – 1000 раз, витаминов – в 1000 раз.

Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.

Для приготовления маточного раствора макро – и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросолей – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).

Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.

Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10 – кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.

Фитогормоны – это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5 – 2,0 мл) спирта (ауксины и гиббереллины), 0,5 н НСl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят объем до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).

Для культивирования клеток, тканей и органов растений используют питательные среды различного состава. Наиболее широко применяют среды Мурасиге-Скуга, Уайта, Гамборга (В₅).

Лабораторная работа № 4

 

Теоретические основы

Культивирование изолированных клеток и тканей происходит на многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различны по составу, однако, в состав питательных сред обязательно входят следующие, необходимые растениям, группы веществ: микроэлементы, макроэлементы, углеводы, витамины и фитогормоны.

Успех в культивировании клеток, тканей и органов прежде всего определяется составом питательной среды. Культура клеток каждого вида растений и даже разных органов и тканей одного и того же вида требует питательной среды определенного состава. Почти любой исследователь пытается разработать оптимальную среду для своего объекта, поэтому количество рецептов питательных сред с каждым годом все возрастает.

Питательные среды для культивирования содержат минеральные соли, углеводы, витамины, регуляторы роста, аминокислоты.

Выбор питательной среды определяется видом растения, которое вводится в культуру, а также задачами эксперимента. Если, в литературе не имеется необходимой информации, работу начинают с применения таких широко используемых питательных сред, как среда Мурасиге-Скуга, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга В₅, Уайта, а затем подбирают концентрации регуляторов роста и органических добавок. В таблице 3 приведены составы некоторых питательных сред. Эти среды оказались эффективными для культивирования in vitro различных видов как однодольных, так и двудольных растений.

Лабораторная работа № 5

Подготовка растительного материала и изоляция эксплантов

Цель работы: изучить теоретические основы способов выращивания куллусных культур и освоить практические навыки работы по их выращиванию, в частности, ознакомиться с первыми этапами выращивания – подготовкой растительного и изоляцией эксплантов.

 

Теоретические основы

Получить стерильный материал из семян огурца и пшеницы селекционных образцов часто бывает достаточно трудно, что связано с необходимостью выбора стерилизующего агента. Наиболее распространены в культуре in vitro стерилизаторы, содержащие активный хлор: гипохлориты кальция и натрия в концентрации 35 г/л; стерилизующие растворы, содержащие ртуть (сулема и диацид), в концентрации 0,1 %; пероксид водорода в концентрации 10-12 %; антибиотики в концентрации 4-5 мг/л. Как правило, стерилизующее вещество должно обеспечивать наибольший процент неповрежденных тканей под семенной оболочкой, способных к росту и новообразованиям при наименьшем проценте инфекции. Продолжительность стерилизации эксплантов следует также тщательно подбирать.

Получение стерильных эксплантов состоит из трех этапов: предстерилизацией, стерилизацией и постстерилизацией.

Перед стерилизацией семена промывают на сите теплой проточной водой, затем помещают в марлевые мешочки, в которые кладут этикетки с указанием номера генотипа. После этого марлевые мешочки вносят в стерильный бокс, где последовательно проводят все операции по стерилизации. Стерильные проростки, полученные из семян, используют в дальнейшей работе для получения:

· эксплантов верхушечных меристем;

· первичного каллуса из тканей листьев, сегментов щитка и изолированных зародышей (пшеница).

Стерильные проростки выращивают с целью изолирования эксплантов для получения каллусной ткани или прямой регенерации растений. В зависимости от задачи опыта семена проращивают на воде или на агаризованной питательной среде.

Приборы и материалы: семена различных растений (20 шт.), стерильные чашки Петри с одним-двумя слоями фильтровальной бумаги, химические стаканы (3 шт.), пробирки, пинцеты, ножницы, марлевые мешочки, колбы на 250 мл со стерильной дистиллированной водой, 0,1 %-ный раствор сулемы, 96 %-ный спирт, спиртовка.

Ход выполнения работы:

Отбирают 10 здоровых, одинаковых по размеру семян, тщательно промывают в мыльном растворе, затем под проточной водой. Помещают в марлевые и в ламинар-боксе погружают на 10 с в 96 % спирт, затем в 0,1 % раствор сулемы или диацида на 10-15 минут. После этого семена промывают в 3-5 объемах стерильной дистиллированной воды и слегка подсушивают. Пинцетом раскладывают по 10 семян в чашки Петри на один-два слоя фильтровальной бумаги и добавляют по 10-15 мл стерильной воды, закрывают крышками. Подготовленные в чашках Петри объекты проращивают в термостате при 25 ^оС или в световой комнате в течение 2-3 суток. В рабочей тетради зарисовывают схему процесса стерилизации и заполняют таблицу, выполненную по форме 1, с указанием стерилизующего агента и экспозиции для стерилизации семян.

Форма 1

 

Характеристика методов стерилизации семян

Метод стерилизации	Стерилизующее вещество	Концентрация, % (мл)	Экспозиция, Мин и с	Цель стерилизации
Предстерилизация
Стерилизация
Постстерилизация

 

Приборы и материалы: семена подсолнечника, гороха, фасоли и др., стерильные чашки Петри, коническая колба на 300… 500 мл, дно которой покрыто ватой, смоченной водой, или фильтровальной бумагой, вода, химические стаканы (2 шт.), пробирки с питательной средой МС (1/2 нормы) без гормонов.

 

Ход выполнения работы

Отбирают 10 здоровых, одинаковых по размеру семын, тщательно промывают в мыльном растворе, затем водопроводной и дистиллированной водой. Помещают в марлевые мешочки и погружают на 1-2 минуты в 96 %-ный спирт, после чего стерилизуют 0,1 % -ным раствором сулемы или 3 % раствором хлорамина в течение 15 минут. Далее промывают в стерильной дистиллированной воде, сменяя ее 5-6 раз.

В ламинар-бокс с помощью стерильного пинцета раскладывают 10 семян в стерильную колбу на влажную вату или фильтровальную бумагу; мелкие семена (табака, моркови и т.д.) можно проращивать в чашках Петри на фильтровальной бумаге, обильно смоченной стерильной водой. Для получения стерильных проростков на агаризованной питательной среде МС в одну пробирку помещают по одному семени. Пробирки, колбы и чашки Петри с семенами ставят в термостат или в световую комнату на 5 дней, где поддерживают температуру 25 ^оС.

Контрольные вопросы:

1. Какие стерилизующие агенты вы знаете?

2. Методика получения стерильных эксплантов.

3. От чего зависит время экспозиции эксплантов?

Лабораторная работа № 6

Посадка и культивирование эксплантов на агаризованной среде

Цель работы: Изучить теоретические основы способов выращивания куллусных культур и освоить практические навыки работы по их выращиванию.

 

Теоретические основы

Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань образуется в результате повреждения на целых растениях, а также в стерильной культуре на эксплантах – фрагментах ткани или органа, используемых для получения первичного каллуса.

Каллусная ткань in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого цвета. Очень редко она может иметь интенсивную зеленую окраску. Темно-коричневая окраска чаще всего появляется при старении каллусных клеток и связана с накоплением фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от этих соединений в питательные среды вносят антиоксиданты. Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции:

· рыхлой, состоящей из сильно обводненных клеток, легко распадающейся на отдельные мелкие клетки;

· средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;

· плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы.

Обязательным условием дедифференцировки растительной клетки и превращения ее вкаллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению, а цитокинины – пролиферацию(деление) дедифференцированных клеток.

Каллусная клетка в результате деления, которого возникла каллусная ткань или каллус, представляет собой один из типов клеточной дифференцировки, присущей всему растению. Для растения каллус является тканью, которая защищает место поранения, накапливает питательные вещества для анатомических структур или утраченного органа. Дифференцированные клетки объединяются в растении, в ткани и выполняют определенные функции. Клетки различаются не только функционально, но и морфологически.

На питательных средах с большим содержание ауксинов (2,4Д) клетки экспланта дедифференцируются и переходят к пролиферации. Особенности дедифференцировки клеток экспланта зависят от генетики и эпигенетики экспланта. Клетки утрачивают прежние функции и морфологию. Причем, чем меньше структурно и химически дифференцирована клетка, тем легче получить каллус. В клетке, готовящейся к делению, стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ДНК, исчезают специфические тканевые белки – антигены, синтезируются новые, специфичные для каллусных клеток. Меняется активность структурных генов и белкового аппарата клеток. Дедифференциация специализированных клеток начинается с обогащения их элементами цитоплазмы: микротрубочками, мембранами ЭПС и комплекса Гольджи, рибосомами, исчезают хлоро– и хромопласты, продукты их деятельности; может образоваться много ядер или увеличиться число хромосом; укрепляются вакуоли.

Каллус, выращиваемый поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенную структуру. Клетки каллуса либо бесцветны, либо имеют желтоватый оттенок. В зависимости от происхождения и условий культивирования различают каллусы: рыхлые, с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга клетками; средней плотности, с зонами меристематической активности; плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.

В биотехнологии, для отработки методик культивирования, чаще всего используют те виды растений, которые и в обычных условиях легко укореняются, регенерируют, образуют каллус. Поэтомубольшинство методов получения и культивирования каллуса разработано для табака. Каллусы можно получить практически из любой части растения, так как клетки табака легко дедифференцируются и переходят к пролиферации. Для культивирования каллусов из листьев табака используют среду Мурасиге-Скуга с добавлением ауксинов (2,4 Д).

Каллусы из различных органов пшеницы на искусственных питательных средах впервые были получены в 1968 году. Их можно использовать для изучения солеустойчивости, устойчивости к температурному стрессу, получения суспензий и протопластов.

Для индукции каллусогенеза обычно используют стерильные пробирочные растения, выращенные из зародышей на средах без гормонов.

Растения для получения каллусов можно вырастить в теплице. Для этого набухшие семена помещают на 5 недель в холодную камеру на яровизацию при 2^оС, проростки высаживают в вегетационные сосуды и выращивают до достижения молочною спелости. Незрелые зародыши выделяют и переносят на питательные среды.

Каллусы можно получать из разных частей растения, в том числе из кончиков корней. Образование каллуса происходит в области первичных и вторичных меристем. Процесс калусообразования зависит от размера экспланта. Оптимальная величина экспланта 5-10 мм³ и масса 20-100 мг.

Многие ткани имеют физиологическую полярность. Поэтому каллус лучше образуется на той стороне экспланта, которая ближе к апикальным меристемам корня. Кончики корней легко образуют каллус, если они помещены на среду горизонтально, тогда как сегменты стебля лучше формируют каллус, если их поместить вертикально.

Для культивирования на питательных средах лучше использовать стерильные корешки, полученные при проращивании семян в стерильных условиях.

Для культивирования стерильных проростков необходимо использовать ламинар – боксы, обеспечивающие посадку эксплантов на питательную среду без заражения микроорганизмов.

Все поверхности ламинара обрабатываются 96% спиртом, простерилизованные инструменты, материалы, растительный материал помещают на стол ламинара и включают УФ – излучение. Через 20 минут выключают УФ и включают биофильтры. Для работы в ламинар – боксе надевают стерильный халат и шапочку, руки обрабатывают 96% спиртом. Пинцеты, скальпели и препаровальные иглы помещают в стакан с 96% спиртом. Перед каждой манипуляцией инструменты обжигают на пламени спиртовки.

Ход работы

1. Листья табака поместить в стерилизующий раствор на 5 минут, затем промыть стерильной дистиллированной водой 3 раза.

2. Стерильным скальпелем вырезать срединную жилку листа с участком паренхимы: длиною 1,5-2 см, шириной 1 см.

3. Поместить экспланты на питательные среды (перед каждой манипуляцией инструменты обрабатывать спиртом и обжигать на пламени спиртовки).

 

4. Чашки Петри с эксплантами перенести в термостат для индукций каллусогенеза при температуре 25 + 2^о С.

5. Результаты зарисовать через 2-4 недели.

 

Получение каллусов из незрелых зародышей и узлов кущения пшеницы

 

Материалы и оборудование: Ламинар-бокс, пробирки с питательной средой, пробирки со стерильными растениями, колосья пшеницы в стадии молочной спелости, инструменты: препаровальные иглы, пинцеты, скальпели, стерильная бумага, 6% раствор хлорамина,стерильнаядистиллированная вода, спиртовки, флаконы с 96 % спиртом.

 

 

Ход работы

1. Незрелые зерновки поместить в стерилизующий раствор на 5 минут.

2. Промыть 3 раза стерильной дистиллированной водой.

3. Простерилизованные зерновки поместить на стерильные бумажные мостики.

4. Препаровальной иглой вычленить зародыши и перенести в пробирки с питательными средами.

5. Пробирки с зародышами закрыть пробками и поставить в штатив.

6. Пробирочные растения пшеницы выложить на стерильные бумажные

7. Матрасики и разрезать на небольшие части по 5-10 мм, выделить междоузлия.

8. Перенести экспланты на питательные среды МС + 2,4 Д в концентрации 4мг/л.

9. Зарисовать каллусы через 2-4 недели, сделать выводы о морфологии каллусов, рассмотреть каллусные клетки под микроскопом.

Лабораторная работа № 7

Теоретические основы

Суспензионные культуры – это одиночные клетки, мелкие, средние и крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2-3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60-100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой питательной средой на круговых качалках со скоростью 100-120 об./мин.