Житомирький національний агроекологічний університет

ЖИТОМИРЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ агроекологічний університет

Факультет ветеринарної медицини

Кафедра мікробіології, вірусології та епізоотології

МЕТОДИЧНА РОЗРОБКА

До лабораторних занять

З курсу

“Ветеринарна вірусологія”

для студентів

ОКР «Магістр», «Бакалавр»

Житомир 2011

Методична розробка до лабораторних занять з курсу “Ветеринарна вірусологія” підготована доцентом, к.б.н. Солодкою Л.О.

 

 

Затверджено на засіданні кафедри мікробіології, вірусології та епізоотології «_____________»_____________ 2011 р., протокол №______

 

Зав. кафедрою, професор Галатюк О.Є.

 

 

Затверджено на засіданні методичної комісії факультету ветеринарної медицини “_____” _______________ 2011 р., протокол №______

 

 

Голова методичної комісії

факультету ветеринарної медицини, професор Довгій Ю.Ю.

 

ЗМІСТ

Заняття №1. Правила відбору та транспортування вірусовмісного матеріалу…………………………...........................................………………….4

Заняття №2. Правила роботи з вірусовмісними матеріалами у лабораторії............................................................................................................. 9

Заняття №3. Методи знищення та інактивації вірусів………………………………………………………….............................12

Заняття №4. Методика дослідження патологічного матеріалу у вірусологічній лабораторії………….........................................................……17

Заняття №5. Підготовка вірусовмісного матеріалу до досліджень……………………………………………………........…………….21

Заняття № 6. Живильні середовища для культур клітин...........................26

Заняття № 7. Методика роботи з культурами клітин..................................34

Заняття № 8. Реакція дифузної преципітації................................................ 40

Заняття № 9. Визначення титру вірусів...................45

Заняття № 10. Методики постановки реакцій гемаглютинації

……………..............................…51

Література……………………………………………………………………….56
Заняття №1

 

Правила відбору та транCпортування вірусовмісного матеріалу.

Правила відбору патологічного матеріалу.

Упаковка та транспортування вірусовмістного матеріалу.

Консервація відібраних вірусовмісних матеріалів.

Правила відбору патологічного матеріалу

Патологічний матеріал необхідно відібрати при появі чітких ознак хвороби або не пізніше, ніж через 2 годин після загибелі чи вимушеного забою тварини (рис.1.1).

Зміна терміну відбору зразків призведе до:

 

Контамінації патматеріалу кишечною мікрофлорою

Зменшення кількості або інактивації вірусу в пат матеріалі

 

Причина – зменшення бар’єрної ролі кишечника

Причина- дія захисних механізмів у хворої, посмертна аутостерилізація у мертвої тварини.

Неможливості накопичення вірусу в лабораторних дослідженнях

Неможливості остаточної ідентифікації збудника

Неможливості постановки точного діагнозу

Рис. 1.1. Наслідки зміни термінів відбору вірусвмістних зразків.

Ветеринарному лікарю, який має відбирає патологічний матеріал, необхідно звертати увагу не тільки на час відбору зразка, але й на інші обставини, зв’язані із тропізмом збудника (табл.1.1):

· вхідні ворота інфекції;

· шляхи розповсюдження вірусу в організмі тварини;

· місця найбільш інтенсивного розмноження вірусу в організмі тварини;

· шляхи виділення збудника в навколишнє середовище.

Табл. 1.1. Місця відбору патологічного матеріалу при різних типах вірусних інфекцій.

Тип вірусної інфекції	Патологічний матеріал
Респіраторна	Мазки та змиви з носу та глотки, соскоби трахеї, носоких перегородок, шматки легенів від трупів та вимушено забитих тварин.
Ентеровірусна (вісцеротропна)	Кал, слизова оболонка тонкого кишечнику
Нейротропна	Шматки головного або спинного мозку
Дермотропна	Шматки ураженої шкіри
Антропна	Кров, паренхіматозні органи

 

Упаковка та транспортування вірусовмісного матеріалу

 

Біологічні особливості вірусів є причиною того, що будь-який вірусовмісний матеріал вважається небезпечним. Тому упаковка патологічного матеріалу завжди робиться багатошаровою (рис1. 2).

 

Рис 1.2. Упаковка вірусвмістного матеріалу.

1. Вірусовмісний матеріал відбирають в стерильний, скляний, герметично закритий флакон (№1). Обідок герметизують парафіном, воском, плівкою “Парафілм”. Кожен флакон маркірують за допомогою етикетки, напис на який роблять простим олівцем по лейкопластирю або водостійким маркером.

Зміст напису на етикетці

Господарство____________________________________________

Дата ____________________________________________

Вид тварини ____________________________________________

Вид матеріалу____________________________________________

 

2. Флакони упаковують у матеріал (№2), що поглинає вологу в випадку пошкодження флакону (вата, цигарковий папір).

3. Склянку, обгорнуту ватою пакують у поліетиленовий пакет, який для герметизації заклеюють лейкопластирем (№3).

4. Пакет ставлять у твердий водонепроникний контейнер (метал, пластик – №5), всередині якого знаходиться протиударний матеріал (вата, папір, тирса – №4).

5. Флакони ставлять в металевий, пластиковий або пенопластовий термос, залитий охолоджуючою рідиною (№6). На термосі є бірка з лейкопластиру, картону, фанери (№7). Напис на ній виконуєтьсяпростим олівцем або стійким до води маркером, а зміст – співпадає з текстом етикетки.

Охолодження потрібно тому, що при температурах нижче 0^оС віруси зберігаються (консервуються), а супутні мікроорганізми (бактерії, гриби, актиноміцети та ін. з місця відбору зразка) значно уповільнюють розмноження або гинуть. Охолоджувальними агентами є:

· рідкий азот (Т = -196⁰С),

· рідкий водень (Т = -203⁰С),

· суміш сухого льоду та етанолу в рівних пропорціях (Т = -71⁰С),

· сухий лід (Т= -70⁰ С),

· суміш трьох вагових частин льоду або снігу з однією частиною солі (Т = -20⁰С).

До патматеріалу обов’язково додається супровідний документ. На основі даного документу співробітники лабораторії вибирають напрямок та методи досліджень патматеріалу. Якщо на думку ветеринарного лікаря збудником хвороби може бути як вірус, так і патогенні мікроорганізми (бактерії або гриби), відібраний патологічний матеріал поділяють на декілька частин (для проведення вірусологічних, бактеріологічних та мікологічних досліджень).

Зміст напису на супровідному документі Вид тварини _________________ Вік тварини _________________ Вид матеріалу _________________ Господарство _________________ Інформація про епізотологічні дані господарства Попередній діагноз Прізвище лікаря ______________ Дата відбору ___________________ Особистий підпис ______________

 

Додаткові речовини

Антибіотики		Консервуючі речовини.
Допомагають знищити або значно уповільнити розвиток супутніх мікробів (бактерії, гриби та ін.) під час транспортування зразка в лабораторію)		Певним чином відтворюють умови, які були в макроорганізмі і допомагають зберігти вірус
Пеніцилін, стрептоміцин, тетрациклінм для бактерій (від 100 до 1000 од/мл матеріалу), ністатин –для грибів (20 од/мл).		Сольові розчини Хенкса та Ерла, розчини желатини (%), альбуміну (%), гліцерин (%)

 

Рис.1.3. Консервування вірусовмісних зразків.

Додавання антибіотиків є необхідним, особливо коли вірусвмістний матеріал одночасно може містити величезну кількість мікроорганізмів іншіх груп (фекалії, вміст кишечника, частинки ураженої шкіри). Потрубно не перевищувати стандартних концентрацій антибіотику, оскільки це вплине на живі клітини лабораторних середовищ, в яких буде розвиватись вірус, і не дасть можливості накопичити його.

Рідина для консервації зразка обов’язково наливається у флакон з пробами носового слизу, змивів із статевих органів тварин та клоаки птиці (відбір проводиться за допомогою тампона, який занурюють у консервант).

Такий консервант як гліцерин не дає можливості мікроскопіювати патматеріал. Тому при його використанні разом з патматеріалом в лабораторію потрібно надсилати мазки-відбитки (при потребі мікроскопі. як одної із стадій лабораторних досліджень)

Завдання:

Заняття №2

Правила роботи

Заняття №4

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕННЯ патологічного МАТЕРІАЛУ у вірусологічній лабораторіЇ

Вірусовмісного матеріалу

Встановлення діагнозу хвороби складається з двох етапів – до лабораторна діагностика і лабораторна діагностика:

· До лабораторна діагностика – це інформація про клінічні ознаки хвороби, епізоотичні дані про спалах хвороби та виявлення патологічних змін в органах і тканинах при наявності загиблих тварин (табл.. 4.1).

· Лабораторна діагностика – це інформація, зібрана в результаті досліджень патологічного матеріалу різними методами (вірусологічний, серологічний, мікроскопічний, гістологічний тощо)

Табл.. 4.1. Методи до лабораторної діагностики вірусних хвороб

Показники	Методика вивчення
Епізоотичні дані	Збирання інформації про видове і кількісне охоплення хворобою поголів’я тварин в хазяйстві, швидкість і територіальне розповсюдження хвороби.
Клінічні симптоми	Реєстрація зміни температури тіла, частоти і форми дихання, частоти пульсу (все – в порівнянні з нормою), порушення апетиту, поведінки, стану шкіряних покривів, слизових оболонок, характер функціонування органів травлення, виділення тощо
Патанатомічні зміни в органах (встановлюють при розтині загиблих або вимушено забитих тварин)	Макроскопічні зміни: форма, розмір, колір, консистенція, положення органів тварин, поява крововиливів, вузликів, везикул та інших утворень. Мікроскопічні зміни в тканинах і клітинах виявляють гістологічними методами. .

ЗАВДАННЯ.

Користуючись схемами, виданими викладачем, дати відповіді на питання:

1. Які види патологічного матеріалу використовують для прижиттєвої, посмертної, ретроспективної діагностики?

2. Які ознаки вірусу дозволяють виявити збудника безпосередньо в патологічному матеріалі?

3. Для проведення яких досліджень не потрібно отримувати вірусовмісну суспензію?

4. Назвіть експрес-методи, які потребують твердого патологічного матеріалу.

5. Назвіть експрес-методи, які потребують підготовки патологічного матеріалу.

6. Види досліджень, за допомогою яких здійснюють ретроспективну діагностику.

7. Яким чином можна накопичити віруси, якщо їх кількість в патологічному матеріалу недостатня?

8. Способи перевірки дії вірусів в тест-об’єктах.

9. Переваги і недоліки тест-об’єктів різних типів.

10. Значення серологічних реакцій при проведення діагностики вірусних хвороб.

11. Значення мікроскопії при проведення діагностики вірусних хвороб.

12. Використання світлової, люмінесцентної та електронної мікроскопії при вірусологічних дослідженнях.

13. Які напрямки діагностики можна провести одночасно при використанні лабораторних тварин?

14. Від чого залежить використання тих чи інших методів або напрямків дослідження при постановці діагнозу у випадку вірусної хвороби?

15. На яких етапах діагностики проводять гістологічні та гематологічні дослідження?

Заняття №5

Підготовка вірусовмісного матеріалу для досліджень.

Центрифугування.

Розведені фізіологічним розчином зразки органів та тканин, змиви з носоглотки, кров, сечу та гомогенізовані фекалії центрифугують при 1500 – 3000 обертах /хв. 15–30 хвилин (в залежності від виду матеріалу). Віріони та їх частинки переходять в рідину над осадом. Останній представляє собою залишки органів або тканин. Після центрифугування рідину над осадом обережно відсмоктують і направляють на обробку антибіотиками.

Обробка антибіотиками.

Обробка підготованої рідини антибіотиками широкого спектру дії проводиться для того, щоб звільнити її від сторонньої мікрофлори, яка потрапила у флакон на місці відбору зразка і не була знищена під час транспортування. Доза антибіотика залежить від виду патологічного матеріалу та можливостей його контамінації, а експозиція продовжується 30 – 60 хвилин при температурі 20 – 25 ^о С (табл.5.2).

 

Табл..5.2. Дози антибіотиків при роботі з вірусовмісними матеріалами.

Назва матеріалу	Антибіотики	Доза антибіотиків, одиниці / мл
Суспензія органів та тканин	Пеніцилін, стрептоміцин тетрациклін, канаміцин для бактерій, ністатин – для грибів	100 - 2000
Гомогенізовані фекалії	Пеніцилін, стрептоміцин тетрациклін, канаміцин для бактерій, ністатин – для грибів	30 – 1000
Суспензія з ураженої шкіри	Пеніцилін, стрептоміцин	200 – 500
Кров	Пеніцилін, стрептоміцин	100 – 200
Сеча	Пеніцилін, стрептоміцин	500 – 1000

Внесення надмірних концентрацій антибіотиків в патологічний матеріал може викликати неспецифічну дегенерацію культури клітин, в який надалі буде вирощуватись вірус.

Завдання:

1. Скласти схему підготовки вірусовмісного матеріалу до дослідження і провести її в боксі для таких видів патологічного матеріалу:

1. кров;

2. виділення з носоглотки;

3. тонкий кишечник;

4. слина;

5. шматки спинного мозоку;

6. шматки ураженої шкіри

7. вміст пустул

8. фекалії

 

2.Скласти схему обробки приміщень або матеріалів і продемонструвати її:

1. підготувати бокс до роботи;

2. підготувати флакони або пробірки з патологічним матеріалом

3. провести обробку боксу після закінчення досліджень;

4. провести обробку залишків вірусного матеріалу після закінчення досліджень.

Заняття №6

Заняття №7

ЗАВДАННЯ.

1. Охарактеризуйте спільні риси і відмінності культур клітин (визначення культур, особливості їх росту, вимоги до поживних середовищ, частота пересіву, економічна ефективність тощо):

· вторинна і постійна культури;

· первинна і вторинна культури;

· первинна і постійна;

· моно шарова і суспензійна.

Заняття 8

Підготовка компонентів РДП.

Підготовка компонентів РДП.

1. Виготовлення 1 - 1,5 % агарового гелю.

Використовують агар фірми Діфко або агар вітчизняного виробництва. Водною основою для агарового гелю є боратний буфер на гіпертонічному розчині хлористого натрію: натрій їдкий - 2 г; кислота борна – 9 г; натрій хлористий – 70 г; мертіолят – 0,05 г; вода дистильована – долити до 1л.

В випадку непрозорого агарового гелю необхідно провести його освітлення розведеним з дистильованою водою (1:2) яєчним білком, целюлозною пульпою, м’ясним фаршем, азидом натрію та ін.

Методика постановки РДП

Реакцію дифузної преципітації можна виконати в чашці Петрі, на предметному склі та в скляному капілярі. У вірусологічній практиці найчастіше використовують дві перші модифікації РДП (табл.8.1).

 

Табл.8.1. Порівняльна характеристика витрат реагентів та часу в різних модифікаціях РДП.

 

№ п/п	Показники	Модифікація РДП
Чашка Петрі	Предметне скло
1.	Компоненти агарового гелю:	вода для гелю агару; боратний буфер; агар Діфко або інший	вода для гелю агару; боратний буфер; агар Діфко або інший
2.	Об’єм агарового гелю	20-25 см^3	1,5–2 см ^3
3.	Товщина гелю	1,5–2 мм	1,5–2 мм
4.	Загальна кількість лунок діаметром 4 мм	(5-7 шт.)* 6 або 7 штампів	(5-7 шт.)*2 штампа
5.	Відстань між лунками	4 мм	4 мм
6.	Облік результатів реакції	через 5-7 діб	через 1-2 доби

 

Негативний контроль,

фабричний антиген

збудник іншої хвороби

діагностичний набір

2 лунки на чашку Петрі,

1 лунка – на скло.

АТ ф,

позитивна сироватка від імунізованих даним збудником

лабораторних тварин, діагностичний набір

 

Рис.8.2 Розміщення компонентів реакції під час проведення ідентифікації вірусу з патологічного матеріалу від хворих і мертвих тварин.

 

АТд,

дослідні антитіла,

Негативний контроль,

фабрична сироватка від тварин

імунізованих іншим збудником,

діагностичний набір

2 лунки на чашку Петрі,

1 лунка – на скло.

АГ ф,

фабричний антиген, діагностичний набір

 

Рис.8.3 Розміщення компонентів реакції під час проведення ретроспективної діагностики (відбір сироватки крові від вакцинованих, хворих або інфікованих тварин).

В підготовані лунки по схемі, маленькими краплями заливають компоненти реакції. Потім предметне скло кладуть в вологу камеру, для якої використовують ексикатор або чашку Петрі з вологою ватою або папером. Вологу камеру залишають при кімнатній температурі або ставлять в термостат. Після необхідного терміну (1-2 доби) проводять облік результатів реакції.

 

ЗАВДАННЯ.

1. Показати розміщення реагентів і результати РДП при проведенні:

· ідентифікації вірусу із патологічного матеріалу на предметному склі

· ідентифікації вірусу із патологічного матеріалу в чашці Петрі

· проведення ретроспективної діагностики на предметному склі

· проведення ретроспективної діагностики в чашці Петрі

2. Виготовлення агару для РДП.

3. Очищення агару для РДП.

4. Підготовка посуду для РДП.

5. Переваги і недоліки РДП.

Заняття №9

Визначення титру вірусів.

Поняття про титр вірусів.

Поняття про титр вірусів

Схема дослідження патологічного або клінічного матеріалу передбачає проведення не тільки якісних аналізів (світлова мікроскопія, реакція імунофлюоресценції, певні види серологічних реакцій). Більшість схем діагностики передбачає використання кількісних аналізів. При проведенні останніх велике значення має концентрація повноцінних вірусів, внесених із досліджуваним матеріалом. Тому визначення кількості активних вірусів в матеріалі (визначення титру вірусу) обов’язково виникає при:

· експериментальному зараженні культур клітин, курячих ембріонів та лабораторних тварин;

· здійсненні різних етапів лабораторної діагностики (реакція нейтралізації, реакція гемаглютинації, імуноферментний аналіз, полімеразна ланцюгова реакція тощо).

Крім того, відомості про кількість активних вірусів в матеріалі необхідні при виготовленні живих та інактивованих вірусних вакцин, діагностичних препаратів (сирі та очищені антигени, імунні сироватки та ін.).

Підрахунки маси, об’єму, загальної кількості вірусів у виготовленій суспензії (навіть при можливості проведення таких вимірів) не дали б відповіді на головне питання: скільки активних вірусних агентів, здатних до розмноження в клітині-хазяїні, знаходиться в даному матеріалі? Питання про активні віруси є таким важливим, тому що тільки вони активні або повноцінні віруси здатні викликати інфекційний процес, за проявами якого і спостерігає дослідник.В процесі даної взаємодії в зараженій системі можна спостерігати:

1. специфічні зміни. Ними є – помітні пошкодження систем клітин (віспини в хоріоналантоїсній оболонці курячих ембріонів, бляшки в моношарі культур клітин, взаємодія вірусу з ерітроцитами);

2. прояви інфекційного процесу. В такому випадку це – загибель курячих ембріонів, клінічні ознаки хвороби або загибель лабораторних тварин, цитопатичні зміни в культурах клітин.

ОДИНИЦІ ВИМІРУ ТИТРУ.

ЗАВДАННЯ

 

1. Поясніть, активність яких вірусів можна визначити в одиницях ВУО. Вкажіть види та кількість лабораторного обладнання, методи його підготовки для проведення титрування вірусовмісного патологічного матеріалу в одиницях ВУО

 

2. Поясніть, активність яких вірусів можна визначити в одиницях БУО. Вкажіть види та кількість лабораторного обладнання, методи його підготовки для проведення титрування вірусовмісного патологічного матеріалу в одиницях БУО.

 

3. До 1мл вихідної вірусовмісної суспензії додали 9 мл розчину Хенкса. По 1мл розведення внесли в 5 матрасів з культурою клітин. Після інкубації підрахували кількість бляшок в кожному матрасі.

Результати: №1 – 30шт., №2 – 35 шт., №3 – 12 шт., №4 – 28 шт., №5 – 32 шт. Необхідно визначити активність вірусу у вихідній суспензії. в одиницях локальних пошкоджень.

 

4. Вкажіть всі можливі помилки лаборанта при проведенні титрування вірусовмісного патматеріалу в гемаглютинуючих одиницях. Поясніть, до яких наслідків може призвести кожна помилка.

 

5. Внесіть в таблицю експериментальні дані про використані матеріали для визначення титру вірусу. На основі даних таблиці визначте кількість матеріалів, які необхідно знезаразити після проведення досліду.

 

Показники	Культура.клітин гр.№1	Культура.клітин гр.№2	Культура.клітин гр.№3
Конт.1	Конт.2	конт.1	конт.2	конт.1	Конт.2
К-ть вірусовмісної суспензії	Для виготовлення першого з трьох розведеннь було використано 1 мл суспензії патматеріалу
К-ть фізрозчину	Для першого з трьох розведеннь використано 9 мл фізрозчину.
Розведення п/ м.
К-ть розведеної суспензії на 1 матрас	1 мл	1мл	1мл	1мл	1мл	1мл
Використано в кожній серії досліду

 

6. 4,5 мл одержаної з патматеріалу вірусовмісної суспензии було використано для виготовлення першого розведення і визначення титру вірусу по методу 50-% інфекційної дії. Назвіть кількість і види об’єктів, які необхідно буде знезаразити після визначення титру.

7. Порівняльна характеристика методів визначення активності вірусного патологічного матеріалу. (Які з методів вимагають мінімальних та максимальних затрат, їх переваги та обмеження).

 

8. Поясніть, активність яких вірусів можна визначити в одиницях ВУО. Вкажіть види та кількість лабораторного обладнання, методи його підготовки для проведення титрування вірусовмісного патологічного матеріалу в одиницях ВУО

 

9. Поясніть, активність яких вірусів можна визначити в одиницях БУО. Вкажіть види та кількість лабораторного обладнання, методи його підготовки для проведення титрування вірусовмісного патологічного матеріалу в одиницях БУО.

 

10. Вкажіть, в яких методах визначення титру вірусів, для чого і яким шляхом використовуються живі тест-об’єкти.

 

ЗАНЯТТЯ №10

Реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) та непрямої гемаглютинації (РНГА).

Використання реакції гемаглютинації у вірусології

Віруси – це антигени. В зараженому організмі у відповідь на їх появу утворюються специфічні білки, які мають назву антитіла (імуноглобуліни). Антитіла реагують із підходящим (комплементарним) антигеном, нейтралізують його, не даючи йому можливості реагувати з речовинами клітин макроорганізму.

Певна кількість вірусів, таких як збудники грипу, парагрипу, кіру, аденовірусних інфекцій, інфекційного рінотрахеїту, ньюкаслської хвороби тощо здатні проникати в кров і взаємодіяти там з еритроцитами (рис.10.1).

 

Проникнення вірусу в кров

Рецептори віріонів (білки капсиду або пепломери) приєднуються до мембрани еритроцитів. Такі поверхневі білки-рецептори називаються гемаглютиніни.

Через певний час еритроцит клітина “набирає” значну кількість вірусних частинок

Важкий комплекс віруси-еритроцит випадає в осад (зсідання еритроцитів або аглютинація)

 

Рис.10.1 Взаємодія вірусів з еритроцитами.

 

Здатність вірусів взаємодіяти з еритроцитами не тільки в макроорганізмі, але й в штучних системах (in vitro) дозволяє проводити такий вид серологічних реакцій як реакції гемаглютинації. Вперше проведена Херстом (1941р.) для вірусу грипу. Еритроцити осідають при безпосередній взаємодії з вірусами. Така взаємодія дозволяє визначити титр вірусу або кількість активних віріонів в суспензії, виготовленій з патологічного матеріалу.

Реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) та

Непрямої гемаглютинації (РНГА)

У вірусологічній практиці існує декілька варіантів постановки реакцій гемаглютинації. Вибір того чи іншого варіанту залежить від біологічних особливостей вірусу, наявності реагентів в лабораторії та інших причин (рис.10.2).

 

Варіанти реакції гемаглютинації
Реакція затримки гемаглютинації (РЗГА) Дозволяє ідентифікувати вірус або визначити титр(кількість специфічних) антитіл в сироватці крові	Реакція непрямої(пасивної) гемаглютинації (РНГА або РПГА) Розроблена Бернетом і Андерсоном (1946р.), доповнена Бойденом (1946 р.) Дозволяє ідентифікувати вірус або визначити наявність антитіл у тварини.
Сироватку із специфічними антитілами додають до вірусної суспензії. Утворюється комплекс антиген-антитіло. При додавання еритроцитів не спостерігається їх осідання (затримка гемаглютинації)	1. Еритроцити, навантажені вірусами (сенсибілізовані АГ еритроцити), додають до сироватки крові тварин. Комплементарні антитіла сироватки взаємодіють з вірусними АГ, закріпленими на еритроциті. Утворений комплекс випадає в осад. 2. Еритроцити з приєднаними антитілами (сенсибілізовані АТ еритроцити), додають до вірусовмісної суспензії. Утворюється комплекс Вірус + (АТ)– Еритроцит, що осідає.

 

Рис. 10.2 Варіанти реакцій гемаглютинації.

Методика постановки реакцій непрямої гемаглютинації (РНГА)

Обов’язковим компонентом РНГА є спеціально підготовані еритроцити (еритроцитарний діагностикум), методику підготовки якого наведено в табл.10.1. Взаємодія даного діагностикуму з вірусами дозволяє виявити ящур, аденовірусну інфекцію ВРХ, інфекційний ларінготрахеїт та інші хвороби.

Табл.10.1 Підготовка сенсибілізованих антигенами еритроцитів

 

№ Етапу	Назва етапу	Суть роботи
	Відбір крові барана або птиці (кури, індики)	Дефібринізація
	Фіксація еритроцитів формальдегідом, глутаровим або акриловим альдегідом	Взаємодія 2 год. при 37 ^оС, відмивка фізіологічним розчином. Еритроцити зберігаються без гемолізу.
	Взаємодія еритроцитів з таніном. 10-15 хв. при 37 ^оС, центрифугування, триразова промивка фосфатним буфером	Еритроцити здатні адсорбувати велику кількість білків
4.	Сенсибілізація еритроцитів вірусами.60 хв. при 37 ^оС, центрифугування, триразова промивка фосфатним буфером	Поверхня еритроцитів “вкрита” величезною кількістю вірусів

Методика постановки реакції затримки гемаглютинації (РЗГА)

Одною з обов’язкових умов РЗГА є те, що до сироватки додають вірусну суспензію з певною концентрацією (титром) активних вірусів. Реакцію проводили за загальноприйнятими методиками у плексигласових панелях за схемою, представленою в таблиці 10.4.

 

Табл.10.4. Методика постановки РЗГА. Визначення титру вірусу в РГА і перевірка робочої дози вірусу 4 ГАО

Компонент, Мл	номер лунки
розбавлення вірусу
ряд Ф: РГА	1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256	1/512	1/1024	Кер
фізрозчин	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
вірусовмісний матеріал	0,2	послідовне перенесення по 0,2 мл до десятої лунки, з десятої лунки – в дезрозчин
1%-ві еритроцити	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
експозиція 20-40 хвилин за кімнатної температури
результат	+++	+++	+++	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
ряд В: контроль ГАО вірусу	2 ГАО	1 ГАО	0,5 ГАО	0,25 ГАО
фізрозчин	0,2	0,2	0,2	0,2
вірусовмісний матеріал, Т=4 ГАО	0,2	послідовне перенесення по 0,2 мл
експозиція 20-40 хвилин за кімнатної температури
Результат	+++	++	+	-

 

В лунки вносять по 0,2 мл фізіологічного розчину, далі – 0,2 мл вірусовмісного матеріалу в першу лунку. Шляхом послідовного переносу вірусовмісного матеріалу у наступні лунки готують дворазові розбавлення вірусу (від 1:2 до 1:1024). В усі лунки додають по 0,2 мл 1% суспензії еритроцитів, панелі струшують. Після 20-30 – хвилинної експозиції за кімнатної температури враховують результат. Якщо вірус зовсім не аглютинує еритроцити (реакція негативна –), вони осідають на дні лунки у вигляді „гудзика”. Якщо вірус аглютинує 100% доданих еритроцитів, в лунках утворюється „парасолька” (реакція позитивна, оцінюється трьома плюсами, +++). За аглютинації вірусом 50% еритроцитів у лунках утворюється „парасолька” з „гудзиком” (реакція на два плюси, ++). Це відповідає 1 ЕД₅₀, яку у реакції гемаглютинації приймають за 1 ГАО.

На другому етапі перевіряють правильність робочої дози вірусу (рис. 10.3). Якщо після 20-30 хвилин експозиції результат оцінюється у першій і другій лунках не менш як на два плюси, а далі гемаглютинації не відбувається, це означає, що виготовлене розведення вірусу справді дорівнює 4 ГАО.

 

 

Рис. 10.3 Перевірка робочої дози вірусу при постановці РЗГА

 

 

На третьому етапі визначають титр АТ в сироватках крові тварин за схемою реакції затримки гемаглютинації. Після постановки реакції та 30-40- хвилинної експозиції панелей, вірус, не зв’язаний з антитілами сироватки, аглютинує еритроцити, утворюючи „парасольки”. Вірус, зв’язаний з антитілами, нездатний до аглютинації еритроцитів і вони осідають у центрі лунки („гудзик”). Отримані значення титрів антитіл порівнюють із діагностичними, після чого роблять висновок про активність досліджуваного вірусу в організмах тварин, у яких було відібрано кров.

ЗАВДАННЯ

1. Поясніть, активність яких вірусів можна визначити в одиницях ГАО. Вкажіть види та кількість лабораторного обладнання, методи його підготовки для проведення титрування вірусовмісного патологічного матеріалу в одиницях ГАО.

 

2. Дайте визначення різним одиницям, що використовуються для виміру активності вірусу (БУО, ВУО, ГАО, ЕД₅₀). Поясніть, в яких випадках використовують ту чи іншу одиницю.

 

3. Схема постановки РНГА у випадку взяття крові у дослідних тварин (ретроспективна діагностика).

 

4. Схема постановки РЗГА у випадку взяття крові у дослідних тварин (ретроспективна діагностика).

 

5. Схема постановки РНГА у випадку роботи з патологічним матеріалом або зараженою вірусом культурою клітин (серологічна ідентифікація).

 

6. Схема постановки РЗГА у випадку роботи з патологічним матеріалом або зараженою вірусом культурою клітин (серологічна ідентифікація).

 

7. Визначення робочої дози вірусу в РЗГА.

 

8. Можливі помилки при постановці РНГА.

 

9. Можливі помилки при постановці РЗГА.

 

10. Можливі помилки при титруванні вірусовмісного матеріалу на першому етапі РЗГА.

 

 

ЛІТЕРАТУРА

1. Ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. – М.: Агропромиздат, 1991. – 431 с.

2. Калініна О.С., Панікар І.І., Скибіцький В.Г. Ветеринарна вірусологія: Підручник. – К.: Вища освіта, 2004. – 432 с.

3. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. – М.: Агропромиздат, 1991. – 528 с.

4. Старке Г. Практическая вирусология. Пер. с немецкого. – М.: Колос, 1970. – 352 с.

5. Кипайкин К.А. Дезинфектология. – Ростов н/Д: Фенікс, 2003 – 448 с.

6. Практикум з ветеринарної вірусології / В.Г. Скибіцький, І.І. Панікар, О.А. Ткаченко та ін. – К.: Вища освіта, 2008. – 208 с.

7. Сергеев В.А., Собко Ю.А. Культуры клеток в ветеринарии и биотехнологии. – К.: Урожай, 1990. – 151 с.

8. Собко А.И., Сюсюкин А.А. Справочник. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных – М.: Агропромизд