Этапы молекулярно-генетических исследований.

1. Взятие материала, маркировка, транспортировка, подготовка проб к исследованию,

хранение.

2. Экстракция ДНК/РНК.

3. Проведение молекулярно-генетических исследований.

4. Анализ и интерпретация результатов, выдача заключения.

Выделение НК из образцов. До начала работы необходимо подготовить пробы для выделения из них ДНК. Для этого сыворотку и плазму крови, мочу, синовиальную и спинномозговую жидкости, мазки и соскобы (доставленные в транспортной среде) концентрируют, мокроту разжижают, биопсийный и аутопсийный материалы аккуратно измельчают.

Процедура подготовки образца (ДНК, РНК) включает очистку образца от форменных элементов, лизис микроба, экстракцию (извлечение) ДНК из биопрепарата и удаление или нейтрализацию посторонних примесей, способных оказать ингибирующее действие на процесс реакции амплификации. Высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. Комплект реагентов для выделения НК должен обеспечивать эффективность экстракции ДНК/РНК (не менее чем 80–95 %) и высокую эффективность амплификации ДНК (в 100000 — 1000000 раз).

Сложный способ – используют с «грязными» пробами: с гемолизом и/или слизью, дебрисом и т.д. Метод направлен на выделение из образца чистых нуклеиновых кислот за счет их избирательной сорбции. Такая очистка ДНК достигается на специальных микроколонках или с помощью сорбентов, приготовленных на основе силикагеля. Выделение ДНК с помощью сорбентного метода является наиболее оптимизированной и технологичной процедурой пробоподготовки и позволяет увеличить чувствительность метода, что влечет за собой увеличение числа выявления возбудителей инфекций, присутствующих в биологических пробах в минимальных количествах.

Простой способ – используют при работе с «чистыми» пробами, т.е. без гемолиза, слизи, дебриса и т.д. Метод подготовки проб состоит в простом лизисе исследуемого материала в сочетании с температурной обработкой.

Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Выбор конкретной методики особенно важен при анализе клеточного осадка мочи или гнойного отделяемого, так как эти образцы содержат большое количество субстанций, способных ингибировать ход реакции полимеризации ДНК-мишени.

Стандартным и ставшим уже классическим считается сорбентный метод получения чистого препарата ДНК/РНК. Сорбентный метод выделения ДНК/РНК в различных модификациях является наиболее предпочтительным для ПЦР-диагностики. Его преимуществом является возможность длительного хранения проб в замороженном состоянии, поскольку ДНК сорбируется на носителе и оттаивание проб не оказывает особого влияния на ДНК/РНК. Метод удобен, технологичен, является наиболее оптимизированной процедурой пробоподготовки, при которой достигается хорошая очистка ДНК. Этот метод позволяет увеличить диагностическую чувствительность и количество выявлений возбудителей инфекций, присутствующих в биологических пробах в минимальных количествах.

На этапе экстракции ДНК/РНК важно обеспечить получение максимального количества высокоочищенной нуклеиновой кислоты. Показателями эффективности экстракции являются минимальные потери ДНК/РНК в процессе экстракции, максимальное удаления ингибиторов и нейтрализации нуклеаз, низкий риск перекрестной контаминации «от образца к образцу».

Для оценки эффективности экстракции комплект реагентов для выделения НК должен содержать внутренний контрольный образец (ВКО), который вносится в пробу на этапе экстракции ДНК/РНК и обеспечивает контроль качества проведения всех этапов анализа.

Все манипуляции, связанные с использованием тест-системы ПЦР проводятся пипеточными дозаторами следующих объемов 0-20 мкл, 0-200 мкл, 0-1000 мкл с использованием полипропиленовых пробирок на 1,5 мл и наконечников к пипеточным дозаторам одноразового использования.

Образцы исследуемого биологического материала в объеме 0,2-0,3 мл помещают в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл и смешивают с равным объемом раствора "Д'' (4 М гуанидин-тиоцианат, 25мМ Na-цитрат, 0,5% саркозил. 0,1М 2-меркаптоэтанол). Добавляют 0,6 мл смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (1:1:0,02), интенсивно перемешивают, инкубируют при -20^оС 15 мин и центрифугируют в течение 5 мин. при 13000 g.

После центрифугирования верхнюю фазу переносят в новую пробирку, добавляют 3 объема 96% этанола и инкубируют при - 20^о С в течение 15 мин. Затем центрифугируют в течение 5 мин. при 13000 g. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в 200 мкл раствора"Д", добавляют 3 объема 96^о этанола и повторяют процедуру охлаждения и центрифугирования.

Полученный осадок НК промывают 80^о этанолом, подсушивают и растворяют в 50 мкл воды.