Прямое определение наличия возбудителей

Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

Высокая специфичность.

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляют уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

Высокая чувствительность.

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. В течение нескольких часов с помощью ПЦР из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Таким образом, можно изучить генетический материал, присутствующий в крошечных количествах. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов -1000-100000 клеток).

Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

Высокая скорость получения результата анализа.

Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя (как культуральные методы), что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4.5 часа.

6.Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.
Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.
Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.). Простые требования к условиям хранения, транспортировки материала от пациента в лабораторию, не требуют сохранения возбудителя в живом виде, по сравнению с бактериологическими и вирусологическими методами.

Ограничения метода ПЦР:

- перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов;

- контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, т.к. в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации;

- контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхности лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложноположительных результатов.

Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств. Накопленный к настоящему времени опыт работы лабораторий, использующих метод ПЦР для диагностики позволяет сформулировать основные требования к организации таких лабораторий и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований позволяет исключить возможность контаминации и получения ложноположительных результатов.

Необходимо территориально разделить различные стадии проведения анализа, размещая их в отдельных помещениях:

- пре-ПЦР-помещение, где производится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами, ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории;
- пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации. В этом помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций. Желательно комнату детекции продуктов амплификации расположить как можно дальше от пре-ПЦР-помещений.

44. Парвовирусы животных. Характеристика вируса Алеутской болезни норок (плазмоцитоза). Методы лабораторной диагностики.

Семейство парвовирусов Parvoviridae («parvus»-маленький) включает два подсемейства, впервые описано в 1928г. Это самые маленькие ДНК содержащие Vir, поражающие позвоночных и насекомых.

Парвовирусы патогенны для млекопитающих, птиц, в т. ч. для человека, широко распространены в природе и у с-х животных и птиц, для них характерно латентное носительство у взрослых особей.

Общие свойства семейства:
l) маленькие размеры 17-28 нм, однонитчатая «+» или «-» нить ДНК, кубический тип симметрии капсида в виде икосаэдра (двадцатигранника);
2) капсид состоит из 32 капсомеров d = 2-4 нм, у Vir нет суперкапсидной оболочки

Структура вирусов семейства Parvoviridae

СР - капсидный протеин

ssDNA - однонитчатая ДНК

3) высокая устойчивость во внешней среде. Термостабильны при t 56°С - 1 час; устойчивы к действию липидорастворителей и кислой среды рН 3-9;
4) репликация вирусной ДНК и сборка вирионов - в ядре клетки, тельца включения (Т-В) - внутриядерные;

5)Для репродукции парвовирусы нуждаются в быстро растущих клетках, так как только на протяжении S-фазы клеточного цикла происходит синтез клеточных ДНК-полимераз, которые используются вирусом для репликации дочерних ДНК.

6) Парвовирусы пантропные проникают во все клетки, а репродуцируются в наиболее митотически активных (быстро делящихся клетках) находящихся в S-фазе клет. цикла, чем и обусловлены изменения в этих тканях (костный мозг, селезёнка, кишечник, миокард, ростки иммунокомпетен тных клеток, ткани плодов).
«Тропизм» с преимуществом локализации в к-ке (много быстро делящихся клет слизист).

Подсемейство Parvovirinae:

- вирус энтерита кошек или панлейкопении (ПЛК);

- вирус энтерита собак («олимпийка») СПВ-2, СПВ -1;

- вирус энтерита норок;

- Парвовирусы - человека (В19), -свиней, -КРС, - кроликов, -енотов, -гусей, -крыс, -мелкий вирус мышей.

Род Amdoparvovirus - вирус Алеутской болезни норок (вирусный плазмоцитоз);
Алеутская болезнь норок (вирусный плазмоцитоз норок) впервые описана Хартзауг и Горем в Сев. Америке в 1956 г. Родства с др. парвовир. не имеет.

АБН контагиозная медленно развивающаяся инфекционная болезнь, характеризующаяся системной (распространённой) пролиферацией лимфоидных клет (генерализованным плазмоцитозом), гипергаммаглобулинемией, явлениями геморрагического диатеза, артериитом, гепатитом, прогрессирующим истощением зверей, рассасыванием плодов у самок; это иммунологическое заболевание.

АБН - свойственно медленное неизбежное прогрессирующее
развитие с лет. исходом за 2-24 мес

В естественных усл. к вирусу АБН восприимчивы норки всех окрасов, норки с гомозиготным рецессивным геном "аа" (алеутские, сапфировые, голубые) заболевают чаще, тяжелее переносят болезнь, чем стандартные.

Вирус бессимптомно персистирует в организме лисиц, песцов, соболей, кроликов, диких зверей, собак, кошек, не теряя патоген. для норок.

Инкуб. период от 30 дн. 2 до лет.
Клин. признаки АБН протекает остро, подостро, хронически и латентно. Первый признак – истощение при хорошем аппетите, появление непере- варенных частиц корма, вялость, угнетение. В прогрессирующей стадии - отмечаются кровотечения из носа, рта, каловые массы с примесью крови, дёгтеобразные. У беременных самок рождение мертворожд. или нежизнесп.

Поражаются все кроветв-е органы.

Вирус стимулирует пролиферацию плазматических клеток, которые вырабатывают АТ, вступающие с ним в реакцию.
АТ не нейтрализуют вирус, продолжается персистенция вируса и не прекращается формирование иммунных комплексов. Появляются аутоантигены, которые стимулируют пролиферацию плазматических клеток и продукцию аутоантител.

Повышается уровень гаммаглобулинов в крови за счет IgG.

В результате отложения иммунных комплексов в стенках артерий, капилляров, в клетках почек, на поверхности Эr, в печени и других органов могут развиться: гломерулонефриты, периартриты, гепатиты, лизис эритроцитов.

Вирусоносительство и вирусовыделение. Источником инфекции являются больные норки, которые выделяют вирус во внешнюю среду с фекалиями, мочой и слюной вплоть до смерти. Заражение горизонтально и вертикально.

Патологоанатомические изменения зависят от формы и течения болезни. Трупы зверей истощены. На деснах, твердом и мягком небе у некоторых норок видны множественные мелкие кровоизлияния и язвы. Развиваются характерные изменения, в первую очередь в органах богатых ретикулоэндотелиальной тканью: костном мозге, селезенке, лимфатических узлах, почках, печени. Наиболее характерны патолого-анатомические изменения в почках.

На поверхности коркового слоя хорошо выделяются точечные крово излияния и мелкие серо-белого цвета очажки. Создается впечатление, что почки обсыпаны песком. Граница между слоями - сглажена. Селезен резко увеличена в 2-5 раз, пятнистая. Лимф. узлы набухшие, сочные.

Плазмоклеточная пролиферация происходит в лимфоузлах, костном мозге, печени, почках.

Диагностика комплексная.
Патматериал: сыворот крови, головной мозг, мезентериальные лимфоузлы, почки, селезёнка, печень, кишечник.
Прижизненный диагноз ставят на основании серологических реакций: МФА, ИФА (ELISA), тимоловая проба, ЙАТ р-я йодной агглютинации, реакция РИЭОФ.

Подготовка лунок в агаровом слое на стекле с помощью вакуум насоса. В лунки вносят компоненты реакции.