Классификация культур тканей. Получение субкультур.

Классификация:

1. переживающие

2. растущие

· Плазменные

· Монослойные

- первичные

- субкультуры

-диплоидные

-перевиваемые

Субкультура (вторичная культура клеток). Получают практически из всех первичных культур клеток, снятых со стекла раствором версена или трипсина, с последующим ресуспендированием в новой питательной среде и пересевом в новые матрасы или пробирки. Монослой формируется через 2–3 сут (хуже субкультивируются куриные фибробласты). Субкультуры по чувствительности к вирусам не уступают первичным культурам клеток, кроме того, они более экономичны. После 10 пассажа, клетки находятся на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток.

30. Заражение культур тканей вирусами. Методы определения результативности заражения культур тканей.

Перед заражением сформировавшихся клеточных культур, ростовую питательную среду меняют на поддерживающую и заражают вирусом из расчета 0,1 мл вируссодержащей жидкости и 0,9 мл поддерживающей среды.

Учитывая, что не все культуры клеток являются чувствительными ко всем вирусам, для каждого возбудителя необходимо подбирать определенный вид культуры ткани.

За зараженными культурами ежедневно наблюдают просмотром под микроскопом и отмечают характер дегенеративных изменений в клетках. Под действием вируса пораженные клетки уже через 24 часа или позже начинают деформироваться, подвергаются деструкции, может появиться зернистость, округление клеток, вакуоли, в некоторых случаях происходит слияние клеток с образованием большой многоядерной клетки или образуются симпласты и синцитии. Пораженные клетки могут группироваться в гроздья и затем разрушаются, отпадают от стенки и появляются пустоты в монослое клеток. Все эти изменения хорошо видны под микроскопом. Некоторые вирусы (чума свиней и др.) могут размножаться в клетках, не вызывая дегенерации и деформации их. Деформация и дегенерация клеток культуры ткани под воздействием различных вирусов может быть различной, но, как правило, всегда носят специфический характер. Способность вируса вызывать определенные морфологические и дегенеративные изменения клеток в зараженных культурах тканей принято называть цитопатогенным действием вируса (ППД). Когда в зараженных культурах тканей ЦПД вируса будет хорошо и четко выражено и более половины пласта клеток (50%) будет дегенерировано, такие культуры удаляют из термостата и хранят до дальнейшего их использования в замороженном состоянии в холодильнике при -20°С (в морозилке бытового или в специальном низкотемпературном холодильнике). Пробирки с четко выраженным ЦПД для дальнейшей работы, если нужно снять клетки со стенки пробирки и для освобождения вируса из зараженных клеток в жидкость, подвергают двух-трех - кратному замораживанию и оттаиванию.

РГАд ставится на культурах ткани при некоторых вирусных болезнях с целью обнаружения вируса в клетках зараженных культур ткани на ранних стадиях размножения вируса, т. е. до появления цитопа- тогенного действия (ЦДД). По своей сущности эта реакция не является серологической и основана на способности зараженных вирусом клеток культуры ткани адсорбировать на себе эритроциты. Для постановки РГАд используют зараженные вирусом культурны ткани в пробирках. В пробирки с культурой ткани, зараженной вирусом, не удаляя поддерживающей среды, вносят 0,2 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов. После этого пробирки оставляют в наклонном положении под углом в 7-10° на 10-15 минут и по истечении этого времени просматривают под микроскопом. При постановке реакции во втором варианте из пробирок с зараженной культурой ткани предварительно сливают культу- ральную жидкость и затем вносят 0,2 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов, пробирки оставляют в наклонном положении на 10-15 минут, затем культуру ткани промывают физиологическим раствором (осторожно споласкивают и сливают) и смотрят под микроскопом. При положительной реакции эритроциты адсорбируются на зараженных клетках и хорошо видны в виде гроздьев, розеток или беспорядочных скоплений. Если клетки не инфицированы вирусом, то на них эритроциты не адсорбируются и свободно плавают в культуральной жидкости^ первом варианте) или смываются при промывании физраствором и не видны (во втором варианте).

РЗГАд. В основе этой серологической реакции лежит способность специфической иммунной сыворотки нейтрализовать гемадсорбиру- ющие свойства клеток культуры ткани, зараженных вирусом. С помощью РЗГАд можно идентифицировать вирус по известной иммунной сыворотке или выявлять антитела в исследуемых сыворотках крови по известному антигену (вирусу). Вирус африканской чумы свиней по РЗГАд имеет 7 серотипов. Для постановки реакции из зараженных пробирок с культурой ткани сливают поддерживающую среду и культуру ткани промывают споласкиванием раствором Хенкса, затем в пробирки вносят но 0,2 мл специфической иммунной сыворотки и 0,8 мл раствора Хенкса (в контрольные пробирки вносят только раствор Хенкса без добавления сыворотки). Сыворотку с зараженной культурой ткани контактируют в термостате или при комнатной температуре 40-60 минут и затем в пробирки вносят по 0,2 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов, оставляют на 10-15 минут и просматривают под микроскопом. Контролем является реакция с нормальной сывороткой. Если сыворотка была идентична вирусу, то специфические антитела предотвращают адсорбцию эритроцитов на клетках и реакция считается положительной. В контрольных пробирках с нормальной сывороткой и в пробирках, не содержащих сыворотки, должна быть гемадсорбция.