Методы получения первично-трипсинизированных культур клеток.

Первично-трипсинизированные культуры. Наиболее широко применяется культура куриных фибробластов. Для ее приготовления берут куриные эмбрионы 10-12 суточного возраста. Скорлупу дважды обрабатывают путем фламбирования. В стерильных условиях эмбрион извлекают в стерильную чашку Петри, декапетируют голову, конечности, удаляют внутренние органы. Кожно-мышечную ткань ножницами измельчают на мелкие кусочки до кашицеобразной массы, переносят в колбу и промывают 3-5 раз от элементов крови раствором Хенкса или другим фосфатно-буферным раствором. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 0,25 % раствор подогретого до 37°С трипсина из расчета 10-40 мл трипсина на 1 г ткани. Для диспергирования ставят на магнитную мешалку на 3-4 минуты (кусочки ткани разделяются на отдельные клетки, о чем свидетельствует помутнение жидкости). Оставляют на несколько минут для осаждения крупных частиц, а взвесь клеток сливают через марлевый стерильный фильтр в колбу, в которую предварительно добавляют 2 % сыворотки крови для остановки действия трипсина. Клеточную взвесь оставляют в холодильнике до окончания трипсинизации.

К осадку добавляют новую порцию трипсина и продолжают трипсинизацию до полного истощения ткани (до 3-4 раза).

Полученную взвесь клеток центрифугируют 5-10 мин при 1000-1500 об/минут. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в небольшом количестве ростовой среды. В камере Горяева подсчитывают количество клеток, доводят ростовой питательной средой до концентрации 400 000 кл/мл при статическом (стационарном) или до 1 200 000 кл/мл динамическом (роллерном) культивировании клеток в зависимости от вида ткани и целей исследования. Клеточную суспензию вносят в культуральную посуду, закрывают резиновыми пробками и ставят в термостат при t 37^оС. Клетки оседают, прикрепляются к стенке сосуда и начинают делиться. Через 24-48 часов формируется клеточный монослой. Клетки хорошо видны под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду меняют на поддерживающую и заражают вирусом.

Учитывая, что не все культуры клеток являются чувствительными ко всем вирусам, для каждого возбудителя необходимо подбирать определенный вид культуры ткани.

После заражения культуру ежедневно просмотривают под малым увеличением микроскопа, отмечают характер дегенеративных изменений в клетках. Под действием вируса пораженные клетки уже через 24 часа или позже начинают деформироваться, подвергаются деструкции, может появиться зернистость, округление клеток, вакуоли, в некоторых случаях происходит слияние клеток с образованием больших многоядерных клеток или образуются симпласты и синцитии. Пораженные клетки могут группироваться в гроздья и затем разрушаются, отпадают от стенки, появляются пустоты в монослое. Все эти изменения хорошо видны под микроскопом. Некоторые вирусы (чума свиней и др.) могут размножаться в клетках, не вызывая дегенерации и деформации. Деформация и дегенерация клеток культуры ткани под воздействием различных вирусов может быть различной, но, как правило, всегда носят специфический характер.

Способность вируса вызывать определенные морфологические и дегенеративные изменения клеток в зараженных культурах тканей принято называть цитопатогенным действием вируса (ППД). Когда в зараженных культурах тканей ЦПД вируса будет хорошо и четко выражено и более половины слоя клеток (50%) будет поражено, их удаляют из термостата и хранят до дальнейшего использования в замороженном состоянии в холодильнике при -20°С (в морозилке бытового или в специальном низкотемпературном холодильнике). Матрасы с четко выраженным ЦПД для дальнейшей работы и если нужно снять клетки со стенки для освобождения вируса из зараженных клеток, подвергают двух-трех - кратному замораживанию и оттаиванию.