Генетика и изменчивость вирусов. Виды изменчивости и их практическое значение.

Вирусам, как и всем живым организмам, свойственны наследственность и изменчивость. Основной особенностью вирусного генома является то, что наследственная информация у вирусов может быть записана как на ДНК, так и на РНК. Геном ДНК-содержащих вирусов двухнитевой (исключение составляют парвовирусы, имеющие однонитевую ДНК), несегментированный и проявляет инфекционные свойства. У вирусов, принадлежащих к родам PoxvirusиHepadnavirusгеном представлен двумя цепочками ДНК разной длины. Геном большинства РНК-содержащих вирусов однонитевой (исключение составляют реовирусы и ретровирусы, обладающие двунитевыми геномами) и может быть сегментированным (представители родовRetrovirus,Orthomyxovirus,ArenavirusиReovirus) или несегментированным.

Вирусные РНК в зависимости от выполняемых функций подразделяются на две группы. К первой группе относятся РНК, способные непосредственно транслировать генетическую информацию на рибосомы чувствительной клетки, т.е выполнять функции иРНК и мРНК. Их называют плюс-нити РНК и обозначают как +РНК (позитивный геном). Они имеют характерные окончания («шапочки») для специфического распознавания рибосом.

У другой группы вирусов РНК не способна транслировать генетическую информацию непосредственно на рибосомы и функционировать как иРНК. Такие РНК служат матрицей для образования иРНК, т.е. при репликации первоначально синтезируется матрица (+РНК) для синтеза –РНК. Такой тип РНК определяют как минус-нить и обозначают –РНК (негативный геном). У вирусов этой группы репликация РНК отличается от транскрипции по длине образующихся молекул: при репликации длина РНК соответствует материнской нити, а при транскрипции образуются укороченные молекулы иРНК. Молекулы +РНК проявляют инфекционность, а –РНК не проявляют инфекционные свойства и для воспроизведения должны транскрибироваться в +РНК.

Исключение составляют ретровирусы, которые содержат однонитевую +РНК, служащую матрицей для вирусной РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). При помощи этого фермента информация переписывается с РНК на ДНК, в результате чего образуется ДНК-провирус, интегрирующий в клеточный геном.

Так же как и у прочих форм жизни нуклеиновые кислоты вирусов подвержены мутациям. Фенотипически мутации вирусного генома проявляются изменениями в антигенной структуре, неспособности вызывать продуктивную инфекцию в чувствительной клетке, термостабильностью, изменением размера и формы бляшек, образуемых под агаровым покрытием. Большинству мутаций присущи реверсии к дикому типу, причем каждая мутация имеет характерную частоту реверсий, которую можно точно измерить. У вирусов выделяют спонтанные и индуцированные мутации.

Генетическая рекомбинация чаще встречается у ДНК-содержащих вирусов или РНК-содержащих вирусов с фрагментированным геномом (вирус гриппа). При генетической рекомбинации происходит обмен между гомологичными участками вирусных геномов.

Изменчивость вирусов, фенотипическое смешивание, полиплоидность. Виды генетической изменчивости у вирусов: мутации, рекомбинации, ошибки при копировании геномов.

Фенотипическое смешение — форма взаимодействия между двумя вирусными частицами, каждая из которых несёт свой собственный уникальный генетический материал. Фенотипическим смешиванием вирусов называют формирование вириона, содержащего структурные белки двух вирусов. Вирусы, участвующие в фенотипическом смешивании, могут быть как близкородственными, так и неродственными. При фенотипическом смешивании гетерогенными, т.е. происходящими от разных вирусов, могут быть пепломеры в липопротеидной оболочке или капсомеры в капсиде. Частный случай фенотипического смешивания - транскапсидация, при которой геном одного вируса оказывается заключенным в капсид другого.

Виды изменчивости:

1. мутации

Мутация - это необратимое изменение генетического материала (ДНК или РНК) вируса. Если копирование ДНК или РНК вируса происходит с ошибкой, возникает мутация. Некоторые вирусы имеют очень высокую частоту мутаций, но это не касается всех вирусов. Как правило, РНК-вирусы, имеют высокую частоту мутаций, в то время как ДНК-вирусы – более низкую. Почему так происходит? Всё дело в разном механизме копирования. Большинство ДНК-вирусов копируют свой генетический материал, используя фермент клетки-хозяина ДНК-полимеразу, который «корректирует» ошибки — обнаруживает их и исправляет. В то время как РНК-вирусы используют фермент РНК-полимеразу, который ничего не корректирует и, соответственно, делает больше ошибок

2. рекомбинация

Обмен фрагментами ДНК и РНК. Рекомбинация обычно происходит, когда два вируса инфицируют одну и ту же клетку в одно и то же время. Так как оба вируса используют клетку для синтеза новых вирусных частиц, то в ней одновременно окажется множество частиц вируса, включая новые образованные геномы. В этих условиях рекомбинация может проходить двумя различными способами. Во-первых, схожие участки вирусных геномов могут соединяться и обмениваться фрагментами, физически разрывая и восстанавливая связи ДНК или РНК. Во-вторых, вирусы с различными сегментами, похожими на крошечные хромосомы, могут обмениваться некоторыми из них. Этот процесс называется реассортацией. Вирусы гриппа - настоящие мастера реассортации. У них восемь сегментов РНК, каждый из которых несет один или несколько генов. Когда два близкородственных вируса гриппа заражают одновременно одну клетку, некоторые из новых вирусов, произведенных внутри клетки, могут иметь смешанные сегменты (например, сегменты 1-4 от штамма A и сегменты 5-8 от штамма B). В частности, хорошо известными «организмами для смешивания» вирусов гриппа являются свиньи. Клетки свиньи могут распознаваться и, следовательно, заражаться вирусами человеческого и птичьего (помимо свиного) гриппа.Если клетка свиньи одновременно заразится двумя типами вирусов, в ней может зародиться новый вирус, содержащий фрагменты генетического материала, например, человеческого и птичьего гриппа. Такой обмен часто встречается в природе у вирусов гриппа. Помните штамм гриппа H1N1 («свиной грипп»), вызвавший пандемию в 2009 году? H1N1 содержал сегмент РНК вирусов человека и птиц, а также вируса свиней из Северной Америки и Азии. Эта комбинация отражает серию реассортаций, которая происходила шаг за шагом в течение многих лет, и в итоге привела к образованию штамма H1N1.

Лекция: I Изменчивость м.б.:

Естественная стихийная – характерна вир. Ящура, Гр, Ньюкасла;

Искусственная (направленная) получают исследователи под влиянием многократных пассажей, или под влиянием мутагенов. Может усиливаться или ослабл-ся.

Снижение вирулентности (аттенуация) достигается разными путями и используются при изготовлении вакцин. Принято различать штаммы:

-природный;

-лабораторный;

-вакцинный.

Все виды изменчивости принято подразделять на 3 вида:

- модификация (адаптация);

-мутация;

-гибридизация.

Модификационная изменчивость фенотипическая (ненаследственная), при такой изменчивости отбор клеткой хозяина адаптированных к условиям.

Адаптационная изменчивость может достигаться при селекции вирусов

в результате многократных пассажирований. Для этих целей адаптацию проводят на лаб. жив.,К.Э.,КК. В результате пассажирования на слабо чувствительных жив. снижается патогенность. На чувствительных животных патогенность усиливается. Vir бешенства многократно пассажируется на мозге кроликов, снижается вирулентность и используется для вакцин.

При чуме свиней провели 300 пассаж.

Аттенуируется Vir чумы свиней на КЭ. Для ослабления снижения вирулентности иногда используютпонижение t –32⁰С.

Модификационная изменчивость используется для получения шт. для жив. вакцин – аттенуированный штамм. Аттенуированные шт могут восстанавливать вирулентность, патогенные свойства.

Риверсия – восстановление ослабленных свойств к исходному состоянию.

Аттенуированные штаммы принято называть от того как их ослабляли:

Лапинизироронный;

Авинизированный;

Культуральный;

Капринизированный.

II-Вид изменчивости – мутация. Наследственное изменение генов. Лежит в основе изменчивости. По механизму мутации принято подразделять на:

-точечные, когда выпадает один нуклеотид;

-абберационные;

-спонтанные мутации;

-естественные;

-индуцированные под влиянием мутагенов.

В основе мутаций лежат:

-изменение составов нуклеотидов;

-последовательность нуклеотидов в NK или перестановки местами нуклеотидов, вставка новых нуклеотидов, выпадения.

Мутации: прямые от дикого штамма;

обратные возврат к дикому.

Вещества и факторы которые вызывают мутацию принято называть мутагены. М.б.:

- физ ф-ры t,УЗ, УФ, рентг. лучи, химич. соед;

- хим.факторы.

Химические факторы можно подразделить на 2 группы:

А) мутагены взаимодействуют с NK Vir в процессе репликации (размножение в клетке). Аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, соединений. Краситель прафлоин, кофеин.

Б) мутагены которые действуют на NK вируса, находится в спокойном состоянии.

К таким соединениям:

Алкилирующие – иприт, азотная кислота, формальдегид;

Азотистая кислота превращает аминооснования в окси

 

III Вид изменчивости Гибридизация в одну клетку попадают разные виды вируса и внутри клетки они взаимообмениваются.

Гибридизация м.б.: генетическая;

негенетическая.

М.б. обмен белков структурой или генами. Негенетический - обмен между белками. К генетической гибридизации относятся:

множественную реактивация;

гибридизация; или рекомбинация?

гетерозиготность;

пересортировка;

транскапсидация.

-Множественная реактивация, когда заражённые клетки разными вирионами с поврежденными геномами ф-ю поврежд. геномом и ф-ю поврежд. генома может взять на себя Vir у кот. ген. не повреждён.

-Рекомбинацией – называют обмен генетического материала между родами Vir.

-Гетерозиготность – нестойкое объединение генома одного Vir с генетическим материалом другого.

-Транскапсидация – объединение генома двух исходных вирусных белков в оболочку одного.

Негенетическая гибридизация включает в себя:

-фенотическое смешивание;

-реактивацию;

-комплементацию;

-стимуляцию;

-интерференцию.

- Фенотипическое смешивание – это обмен в белковой оболочке вириона. Гибриды у которого геном одного исходного вируса, а белки от двух исходных вирусов. У такого Vir Ag и одного и другого Vir.. В дальнейшем пойдёт расщепление.

- Комплементация и стимуляция взаимное использование вирусов ферментов другого. В частности вирус Саркомы сам не может размножаться в клетке, но для построения своей оболочки использует белки вируса лейкоза кур.

- Интерференция –такое взаимоотношение, при котором один из вирусов ранее попавших в кл. тормозит, угнетает развитие другого вируса позже попавшего в клетку. В основе лежит, то что первый Vir проникший в клетку, способный вырабатывать ИФ, который будет препятствовать репродукции другого вируса. При подборе поливалентных вакцин учитывается явление интерференции.

9. Принципы получения живых противовирусных вакцин контроль (примеры).

Живые вакцины - это биологические препараты, содержащие штаммы вирусов, утратившие способность вызывать клинически выраженное заболевание, но сохранившие способность репродуцироваться в организме восприимчи­вого животного и стимулировать выработку специфических факторов противовирусного иммунитета (антител).

Основной этап - получение аттенуированных (слабовирулентных) штаммов вирусов. Основные трудности связаны с получением стабильного иммуногенного вакцинного штамма вируса и разработкой методов его контроля.

Для изготовления живых вакцин используют селекционированные естественные, аттенуированные и гетерологические штаммы вирусов. Естественные (выделенные из природы) авирулентные или слабовирулентные штаммы - это спонтанные мутанты, утратившие способность вызывать заболевание, но сохранившие иммуногенные свойства. Аттенуированные, т. е. ослабленные экспериментатором штаммы это индуцированные мутанты. Их обычно получают в лабораториях путем целена­правленного воздействия на эпизоотические штаммы различными физическими и химическими мутагенами или чаше путем пассажей вирулентного вируса через гетерологические (маловосприимчивые) биологические системы. В принципе, живые вакцины могут содержать и «дикий» тип вируса, т. е. неослабленный вирус, но в таком случае его вводят в организм неестественным путем, в результате чего ограничивается репликация вируса в месте введения, вызывается лишь бессимптомная инфекция, заканчивающаяся выработкой иммунитета.

Любой вакцинный штамм должен быть хорошо изучен, классифицирован, клонирован и паспортизирован. В паспорте указываются основные генетические признаки, выявляемые, постоянно воспроизводимые и контролируемые в процессе поддержания его жизнеспособности и хранения (остаточная вирулентность, способность репродуцироваться, активность в конкретной биологической системе, особенности проявления инфекционного действия, спектр гемагглютинации, степень чувствительности к физическим и химическим факторам). Вакцинные вирусные штаммы должны обладать генетической и фенотипической стабильностью. Их приживаемость в привитом организме должна быть выраженной, а способность к репродукции ограниченной. Эти признаки должны быть наследственно закрепленными. Вакцинные штаммы не должны подвергаться реверсии (возврату в исходное состояние) в том числе и при пассажах на естественно восприимчивых животных. Они не должны вызывать специфического инфекционного процесса у животных после введения им массивных доз вакцинного штамма (в 5—10 раз превышающих иммунизирующую дозу). Живые вакцины должны создавать напряженный иммунитет не менее чем у 70% однократно вакцинированных животных, этого достаточно для создания условий, препятствующих дальнейшему распространению болезни в неблагополучном стаде. Вакцинные штаммы размножаются в привитом организме до тех пор, пока его защитные механизмы не затормозят их развитие.

Технология изготовления живых вакцин сводится к культивированию вакцинного штамма в какой-либо биологической системе, накоплению вируса, очистке и концентрации, расфасовке, лиофилизации и контролю готового препарата.

Для предупреждения размножения бактерий, случайно попавших во время сбора и расфасовки вируссодержащего материала, в состав живых вакцин иногда включают антибиотики. Для профилактики контаминации живых авианизированных вакцин микоплазмами и вирусами применяют прединкубационную термообработку яиц при 42—45°С в течение 4 - 7 часов с последующим переводом их на обычный режим инкубации, кроме того, для инактивации вирусов лейкозов готовые вакцины выдерживают при 4°С не менее 4 педель. Наиболее желательно для изготовления живых вакцин использовать чистые биологические системы: эмбрионы и эмбриональные культуры клеток японских перепелок или кур, свободных от специфических патогенных факторов. Выпускаются живые вакцины, как правило, в лиофильно высушенном виде. В процессе высушивания активность вирусов не должна снижаться более чем в 10-15 раз, что обеспечивается за счет добавок стабилизирующих веществ.

В живой вакцине вирус сохраняет потенциальную способность изменяться в сторону снижения антигенности или повышения реактогенности, или даже вирулентности.

Преимущества и недостатки живых вакцин.

Технология изготовления живых вакцин, как правило, проста, они относительно дешевы, выпускаются чаще в сухом виде, поэтому удобны для применения. Вызывают активацию всех компонентов иммунной системы, стимулируют общий (системный) и местный иммунный ответ на каждый из защитных антигенов. Создают продолжительный и напряженный иммунитет за счет приживаемости, размножения и диссеминации в организме вакцинного штамма, при этом иммунитет формируется быстро, на первых этапах обычно за счет интерференции, а затем обусловливается накоплением вируснейтрализующих антител. Их можно вводить подкожно, внутримышечно, интраназально, а также аэрозольным (аэрогенным) и энтеральным (с кормом или водой) способом.

В зависимости от физиологического состояния животных живые вакцины могут вызвать поствакцинальные реакции. У животных может быть лихорадка, активация хронических и латентных инфекций, снижение продуктивности, избыточная смертность, аборты, аллергические реакции, врожденные уродства, низкая устойчивость к заражению. При использовании живых вакцин необходимо учитывать уровень остаточной вирулентности вакцинного штамма. Живые вакцины хранят в себе потенциальную опасность, связанную с возможной реверсией, т, е; возвратом вакцинного штамма в исходное (вирулентное) состояние. При культивировании вакцинных штаммов в эмбрионах птиц, культуре клеток или в организме животных имеется потенциальная опасность контаминации, что усложняет контроль и сдерживает широкое применение живых вакцин. Может наблюдаться длительная персистенция вакцинного штамма в организме животного. Чтобы сохранить жизнеспособность вакцинного штамма, необходимо соблюдать условия хранения и транспортировки живых вакцин (не выше 8°С) и применять в соответствии с инструкцией, прилагаемой к препаратам. Нарушение вакуума и попадание влаги в ампулу с вакциной, воздействие света и тепла инактивирует штамм, утрачиваются его иммуногенные свойства. Ввиду отсутствия в большинстве живых вакцин консервантов при вскрытии ампул и растворении содержимого необходимо строго соблюдать правила асептики. Место введения препарата в организм животного нельзя обрабатывать дезинфицирующими веществами. Разведенную живую вакцину необходимо быстро использовать (в течение 2 часов), остатки уничтожать сжига­нием или кипячением

Живые вакцины. Защищают от полиомиелита, кори, краснухи, гриппа, эпидемического паротита, ветряной оспы, туберкулеза, ротавирусной инфекции. Основу препарата составляют ослабленные микроорганизмы — возбудители болезней. Их сил недостаточно для развития значительного недомогания у пациента, но хватает, чтобы выработать адекватный иммунный ответ.