Особенности работы вирусологических лабораторий, оборудование. Техника безопасности при работе с вирусами.

Особенности работы вирусологических лабораторий, оборудование. Техника безопасности при работе с вирусами.

Вирусологическая лаборатория — это учреждение, деятельность которого направлена на изучение вирусов и вирусных заболеваний, производство вирусных препаратов, к числу которых относятся вакцины, иммунные сыворотки и проч. Вирусная лаборатория состоит непосредственно из лаборатории, а также подсобных помещений. В последних проводятся работы, связанные с:

· Обработкой и стерилизацией лабораторной посуды.

· Приготовлением питательных сред.

· Лиофилизацией вирусов и т.п.

Помещение вирусологической лаборатории в обязательном порядке должно быть оборудовано системой эффективной приточно-вытяжной вентиляции, водопроводной системой (ГВС и ХВС), электрифицировано. Помимо этого, желательно наличие централизованной системы сжатого воздуха и вакуума.

Вирусологическая лаборатория – отдел в ветеринарной лаборатории.

Начинается с приемного отделения, куда доставляют пат. материал, далее записывают в журнал, присваивают номер.

Бытовые помещения, автоклавная (предназначенная для стерилизации посуды, питательных сред, обезвреживания инфекционных материалов. Обратите внимание: в обязательном порядке устанавливаются два автоклава: один — для чистых материалов, а второй — для инфицированных.), моечная(где происходит очистка приборов, посуды и аппаратуры.), три бокса с предбоксами: работа с пат материалом, заражение куриных эмбрионов, изготовление культур тканей; виварий (отдельно от лаборатории) – для лабораторных животных (здоровые, подопытные).

Оборудование: микроскопы, автоклавы (пар), сухожаровой шкаф (жар), термостат (поддержание температуры), водяная баня (вода), весы, холодильник, низкотемпературный прилавок, центрифуга (желательно с охлаждением).

Проведение отбора и консервирования пат материала: пат материал необходимо отбирать стерильными инструментами в стерильные емкости; пат материал может быть прижизненным и посмертным. (при жизни – истечения, сыворотка крови; посмертно – орган, пораженный вирусом).

Техника безопасности:

При работе с вируссодержащим материалом необходимо выполнять следующие требования: 1) не допускать рассеивания вирусов во внешней среде; 2) предотвратить контаминацию (загрязнение) вируссодержащего материала посторонней микрофлорой; 3) обеспечить личную безопасность. В лаборатории запрещается курить или принимать пищу, ходить и разговаривать во время работы.

Работу с вируссодержащим материалом в лаборатории проводят только в спецодежде, выход за пределы лаборатории в спецодежде; вынос оборудования, инвентаря и т. д. без дезинфекции запрещен.

Правила техники безопасности для студентов в вирусологическом практикуме: 1. В лабораторию входить в халате, шапочке, косынке. 2. Личные вещи на рабочий стол не класть. 3. На рабочем месте соблюдать чистоту и порядок, начинать работу только с разрешения преподавателя. 4. Пользоваться только стерильными инструментами, посудой. 6. Открывать и закрывать пробирки, флаконы у пламени горелки. 7. Все отходы после занятий собирать в специально подготовленную посуду. 8. Запрещается выливать и сбрасывать отходы в раковину. 9. Если студент случайно разольет вируссодержащий материал, он обязан немедленно сообщить преподавателю и вместе с ним принять меры. 10. В конце занятия студент должен привести в порядок рабочее место, сдать дежурному весь материал, инструменты, вымыть руки и обработать дезинфицирующим материалом.

Иммунитет, виды иммунитета.

Иммунитет — (лат. immunitas — освобождение) — защита организма от генетически чужеродных организмов и веществ, к которым относятся микроорганизмы, вирусы, черви, различные белки, клетки, в том числе и собственные изменённые клетки организма.

-клеточный (такой тип иммунного ответа, в котором не участвуют ни антитела, ни система комплемента. В процессе клеточного иммунитета активируются макрофаги, натуральные киллеры, антиген-специфичные цитотоксические Т-лимфоциты, и в ответ на антиген выделяются цитокины. Система клеточного иммунитета выполняет защитные функции следующими способами: -путём активации антиген-специфических цитотоксичных Т-лимфоцитов, которые могут вызывать апоптоз соматических клеток, демонстрирующих на поверхности эпитопы чужеродных антигенов, например, клеток, заражённых вирусами, содержащими бактерии и клеток опухолей, демонстрирующих опухолевые антигены; -путём активации макрофагов и натуральных киллеров, которые разрушают внутриклеточные патогены; -путём стимулирования секреции цитокинов, которые оказывают влияние на другие клетки иммунной системы, принимающие участие в адаптивном иммунном ответе и врождённом иммунном ответе. Клеточный иммунитет направлен преимущественно против микроорганизмов, которые выживают в фагоцитах и против микроорганизмов, поражающие другие клетки. Система клеточного иммунитета особенно эффективна против клеток, инфицированных вирусами, и принимает участие в защите от грибов, простейших, внутриклеточных бактерий и против клеток опухолей. Также система клеточного иммунитета играет важную роль в отторжении тканей)

-гуморальный (дин из механизмов реализации защитных свойств организма в жидкостной среде. В отличие от клеточного иммунитета, гуморальный защищает внеклеточные пространства. В-лимфоциты – плазмоциты – иммуноглобулины)

-врожденный (с самого рождения (ещё до первой встречи с антигеном) защищает организм против всего чужеродного, т. е. он не специфичен. Таким образом, повторная встреча с тем или иным патогенным микроорганизмом не приводит к изменениям врождённого иммунитета, но повышает уровень приобретённого. Врождённый иммунитет активируется при первом появлении патогена быстрее, но распознаёт патоген с меньшей точностью. Он реагирует не на конкретные специфические антигены, а на определённые классы антигенов, характерные для патогенных организмов (белки вирусного капсида, продукты метаболизма глистов и т. п.). Врождённый иммунитет может быть наследственным (видовым) и индивидуальным)

-приборетенный (это специфический индивидуальный иммунитет, т. е. это иммунитет, который имеется конкретно у определённых индивидуумов и к определённым возбудителям или агентам.Главными характеристиками приобретённого иммунитета являются специфичность и иммунологическая память. Чем чаще организм встречается с патогеном, тем быстрее и активнее вырабатываются антитела, следовательно — сильнее защита)

-естественный (возникает самостоятельно в процессе жизни организма. Естественный иммунитет делится на активный (после перенесённых заболеваний) и пассивный (например, с молоком матери). До 6 месяцев малыша защищают антитела, передающиеся от матери с грудным молоком. Поэтому важным является исключительно грудное вскармливание. Иммунитет матери защищает ребёнка. Дети, которые находятся на искусственном вскармливании, слабо защищены, т. к. собственных антител у них мало. Только к 6 месяцам организм самостоятельно начинает вырабатывать антитела. Собственный иммунитет ребёнка формируется только к концу первого года жизни)

-искусственный (рганизм приобретает в результате применения медицинских препаратов (вакцин и сывороток). Вакцина — медицинский препарат, содержащий ослабленные или убитые микроорганизмы. Вакцина вводится абсолютно здоровому человеку для предотвращения заболевания в будущем. Сыворотка — медицинский препарат плазмы крови без фибриногена, содержащий готовые антитела к определённому патогену (заражающему микроорганизму). Сыворотку получают из крови заражённого данным заболеванием животного (коровы, лошади и т. п.). Сыворотка с чужими антителами вводится заболевшему человеку в случае, когда организм не способен произвести достаточное количество антител)

ИЗОЛЯТ

ГЕНОТИП

      Номенклатура таксонов в царстве Vira

Основными таксономическими единицами являются:

Порядок (-virales)

Семейство (-viridae)

Подсемейство (-virinae)

Род (-virus)

Вид (-virus)

Номенклатура не выделяет подвиды, штаммы и изоляты.

Например: сем. Аdenoviridae, род Mastadenovirus, род Aviadenovirus, виды - Human mastadenovirus C, - Canine mastadenovirus A

Классификация вирусов по Балтимору (англ. Baltimore classification)

— классификация вирусов в группы в зависимости от типа геномной нуклеиновой кислоты (ДНК, РНК, одноцепочечная, двуцепочечная) и способа ее репликации. Предложена Дэвидом Балтимором в 1971 году.

Семейства кластеризованы в соответствии с видом генома (ДНК, РНК,одноцепочечная, двуцепочечная) и способа ее репликации.

Семейства кластеризованы в соответствии с видом генома -

ü днДНК – двунитчатые ДНК

ü онДНК - однонитчатые ДНК

ü днРНК - двунитчатые РНК

ü (+)РНК – РНК с позитивной полярностью (мРНК)

ü (-) РНК - РНК с негативной полярность и те, для репликации которых требуется реакция обратной транскрипции (РТ-вирусы, или ретроидные вирусы).

Семейства:

Двуцепочечная днк: Семейство Herpesviridae (Герпесвирусы), Семейство Adenoviridae (Аденовирусы), Семейство Papillomaviridae (Папилломавирусы)

Одноцепочечная днк: Семейство Parvoviridae (Парвовирусы)

Одноцепочечная +Рнк: Nidovirales, Picornavirales (Picornaviridae), Tymovirales, Astroviridae, Caliciviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Virgaviridae

Одноцепочечная –рнк: Bunyavirales, Mononegavirales(семейство Bornaviridae), Arenaviridae, Ophioviridae, Orthomyxoviridae и Deltavirus.

двуцепочечная +рнк: Caulimoviridae и Hepadnaviridae, в том числе вирус гепатита B.

ДНК-содержащие вирусы, репродукция которых происходит в ядре, используют для транскрипции клеточную полимеразу.

К этим вирусам относятся паповавирусы, аденовирусы, випусы герпеса.

ДНК-содержащие вирусы, репродукция которых происходит в цитоплазме, не могут использовать клеточный фермент, находящийся в ядре. Транскрипция их генома осуществляется вирусспецифическим ферментом — ДНК-полимеразой, которая проникает в клетку в составе вируса.

К этим вирусам относятся вирусы оспы и иридовирусы.

Сущность, техника постановки и учет реакции гемагглютинации (РГА).

РГА не относится к серологическим реакциям(!!!), так как в ней не уча­ствует иммунная сыворотка, т. е. антитела. В основе РГА лежит агглю­тинация, т. е. склеивание эритроцитов человека, животных и птиц под действием вируса. было установлено, что способность вызывать агглютинацию эритроцитов обладают не только вирусы гриппа, но и некоторые дру­гие представители миксовирусов (вирусы парагриппа, паротита, болез­ни Ньюкасла и др.), аденовирусы, вирусы оспы, некоторые нейротропные вирусы и другие. РГА используется для индикации (обнаружения) вирусов при проведении ориентировочной диагностики, для титрования вирусов по гемагглютинирующим свойствам (установление гемаг- глютинирующих единиц - АЕ). С помощью РГА нельзя иипировать и идентифицировать вирусы, т. к. в ней не участвует сыворотка (анти­тело). Гемагглютинацией обладают не все вирусы. Миксовирусы агг­лютинируют эритроциты многих видов животных, кур и человека. При постановке РГА нужно знать, какие эритроциты данным вирусом агг­лютинируются.

Основу феномена агглютинации, вызываемого вирусами, составляет адсорбция вирусов на поверхности эритроцитов, сопровождающаяся склеиванием (агглютинацией) последних и выпадением в осадок. Ме­ханизм РГА заключается в следующем: на поверхности эритроцитов имеются рецепторы мукопротеидной природы, способные адсорбиро­вать до 10.000 вирионов, а на поверхности гемагглютинирующих ви­русов располагаются гемагглютинины - сложные белковые тела с энзиматической активностью. При смешивании эритроцитов с вируссо­держащей жидкостью гемагглютинины вируса при помощи фермента муциназы вступают во взаимодействие с рецепторами эритроцитов, в результате чего происходит адсорбция вирусов на эритроцитах. Вирионы, адсорбированные на одном эритроците, способны свободны­ми поверхностями соединяться с другими эритроцитами, образуя при этом мостики между ними, ч го и приводит к склеиванию (агглютина­ции) эритроцитов.

Адсорбция вирусов на эритроцитах является энзиматическим про­цессом. Через некоторое время после проявления гемагглютинации связь между вирусами и эритроцитами нарушается, так как вирусная муциназа разрушает рецепторы эритроцитов и вирусы элюируют (от­соединяются) с эритроцитов. Это надо иметь в виду при учете реак­ции. После элюции вируса эритроциты оседают на дно пробирки в виде бугорка (холмика, пуговки). Использованные в РГА эритроциты вто­рично этим же вирусом не агглютинируются, т. к. чувствительные к данному вирусу рецепторы у эритроцитов уже разрушены, но могут быть агглютинированы другими вирусами, к которым сохранились рецепторы.

В качестве антигена для РГА берут любой материал (патматериал в виде суспензии из органов, смывы, материал из зараженных кури­ных эмбрионов, культур ткани и др.), в котором предполагается нали­чие вируса. Материал должен быть жидким, без крупных частичек.

Эритроциты применяют в виде 1% взвеси в физиологическом ра­створе. Они могут быть свежеприготовленные или консервированные.

Физиологический раствор для постановки реакции используют с рН 7,0 - 7,4.

Для постановки ориентировочной РГА на чистое и хорошо обез­жиренное предметное стекло наносят одну каплю вируссодержащего материала, к ней добавляют одну каплю 5%-ной взвеси эритроцитов и перемешивают стеклянной палочкой. В положительных случаях че­рез несколько минут произойдет агглютинация эритроцитов в виде об­разования хлопьев.

При постановке реакции пробирочным способом используют се­рологические пробирки или панели (пластины из стекла или оргстек­ла) с лунками. В этом случае предварительно готовят двукратные раз­ведения вируссодержащего материала, начиная с 1:10 (и далее дву­кратные разведения: 1:20, 1:40, 1:80 и т.д.) и до 1:1280 (иногда и более высокие). К каждому из разведений вируссодержащего материала, взя­тых в объеме по 0,5 мл, затем добавляют по 0,5 мл 1%-ной взвеси эрит­роцитов и пробирки после встряхивания оставляют в покое на 30-60 ми­нут при комнатной температуре, а затем учитывают результаты. Оце­нивают реакцию в крестах (плюсах).

При оценке реакции в крестах обращают внимание на характер осад­ка. Если эритроциты осели тонким слоем равномерно по дну пробир­ки (в виде зонтика), реакцию оценивают в четыре креста (++++). При оседании эритроцитов в виде зонтика, но с наличием менее равномер­ного распределения его по дну - три креста (+++). Если эритроциты осели в виде зонтика, но с волнистыми краями и в центре дна имеется более толстый слой из осадка неагглютинированных эритроцитов, ре­акцию считают в два креста (++). Значительное оседание эритроци­тов плотным диском в центре пробиркой с зернистой каймой по кра­ям (при наклоне пробирки эритроциты сползают) оцениваются в один крест (+). Если же эритроциты оседают на дно пробирки в виде хол­мика (бугорка) с ровными краями, при наклоне пробирки сползают такую реакцию считают отрицательной (-).

Титром вируса считается то наибольшее разведение его, которое способно давать реакцию гемагглютинации не менее чем в два (++) креста. Такое разведение содержит одну гемагглютинирующую еди­ницу (1 АЕ).

Практика: 2 компонента: аг, однопроцентные эритроциты. (только гемагглютинирующий вирус)

Цель постановки:

-определить является ли вирус гемагглютинирующим

-определить титр вируса

Механизмы реакции:

У эритроцитов имеются рецепторы мукопротеидной природы, а у вирусов – фермент муциназа, и при их соединении одна вирусная частица может соединиться с несколькими эритроцитами, за счет чего на стекле образуются хлопья, а в лунках – зонтики. Реакция непродолжительная, через некоторое время муциназа вирусов разрушает рецепторы эритроцитов, и они оседают на дне в виде пуговки.

Реакцию можно поставить в 2х вариантах:

1. является ли вирус гемагглютинирующим.

Берут каплю эритроцитов и каплю вируса вносят на предметное стекло. В положительном случае (если вирус гемагглютинирующий) – хлопья, если отрицательный случай, то жидкость равномерно окрашивается в красный цвет.

2. используют планшеты\планшетки (такая форма с лунками, усеченными пробирками)

Вносят 0,2 мл физ. Раствора во все, и в первую 0,2 мл вируса. Перемешивают в первой лунке, потом переносят вирус во 2,3,4 и тд. Делают ряд последовательный двухкратных разведений.

Разведение по лункам: 1- 1:2; 2- 1:4; 3- 1:8, 4- 1:16 и тд.

Затем в каждую лунку вносят по 0,2 мл 1%-ых эритроцитов.

Контакт 20-30 минут

Учет

Планшетку под углом 45 градусов – эритроциты стекают в виде слезки (мало вируса).

Параллельно ставят контроь (0,2 мл физ р-ра, 0,2 эритроцитов) на самоагглютинацию эритроцитов

Сущность, техника постановки и учет реакции задержки гемагглютинации (РЗГА).

РЗГА широко применяется в практике как для выявления и оп­ределения титра антител в сыворотке крови больных и вакциниро­ванных животных, так и для идентификации выделенных вирусов по известной сыворотке. Ставить эту серологическую реакцию мож­но только с теми вирусами, которые обладают гемагглютинирующими свойствами.

Сущность РЗГА заключается в том, что, если к вирусу, обладающе­му гемагглютинирующими свойствами, добавить сыворотку, содержа­щую специфические вирусу антитела, и смесь выдержать в контакте 30-60 минут, а затем внести взвесь эритроцитов, гемагглютинация не наступит, т.е. произойдет задержка (торможение) гемагглютинации. Следовательно, здесь гемагглютинирующая способность вируса нейт­рализуется специфическими антителами.

При постановке реакции следует иметь в виду, что некоторые жид­кости организма (сыворотка крови, моча, слюна, молоко и др.) могут содержать ингибиторы, которые могут тормозить реакцию и задержи­вать гемагглютинацию. В этих случаях нормальная сыворотка, т. е. сы­воротка от здоровых животных, может дать задержку гемагглютинации, что приведет к ошибочным результатам. В сыворотках крови некото­рых здоровых людей и животных выявлено два типа ингибиторов - тер­мостабильные и термолабильные. Термолабильные ингибиторы обна­руживаются в бета-фракциях глобулина и они обладают свойствами бета-глобулина, подавляют гемагглютинацию, нейтрализуют вирус и являются важным фактором противовирусного иммунитета. Они ме­шают постановке РЗГА и от них избавляются инактивированием сы­воротки при 56-65°С в водяной бане 30 минут. Термостабильные ин­гибиторы (ингибиторы Френсиса) содержатся в альфа-фракции гло­булина, они устойчивы к высоким температурам (даже к кипячению) и действию щелочи, подавляют гемагглютинацию, но вируснейтрали- зующими свойствами не обладают. Удаляют термостабильные инги­биторы из сывороток крови обработкой сывороток углекислым газом, фильтратом культуры Вибриона холеры или перйодатом калия.

Для постановки РЗГА необходимо предварительно провести титрацию вируса в РГА, чтобы определить 1 АЕ. При постановке РЗГА вирус берут в титре 4 АЕ, т. е. разведение в 4 раза меньшее, чем был титр вируса в РГА. Например, титр вируса, содержащий 1 АЕ, равен 1:64, значит 4 АЕ будет содержаться в разведении вируса 1:16.

Все сыворотки перед постановкой РЗГА прогревают для удале­ния термолабильных ингибиторов в течение 30 минут при темпера­туре 56-65°С в зависимости от вида животных.

Для постановки реакции в одном ряду пробирок или лунок готовят разведения сыворотки на физиологическом растворе. Обычно в пер­вой пробирке готовят разведение 1:10, а далее из него двухкратные разве­дения до 1:1280 и иногда более высокие. Затем из этого ряда по 0,25 мл соответствующих разведений сыворотки переносят во второй ряд про­бирок и туда же добавляют по 0,25 мл вируса, содержащего 4 АЕ. Встря­хиванием пробирок жидкость перемешивают и смесь выдерживают 30-60 минут в контакте при комнатной температуре или в термостате. После этого во все пробирки вносят по 0,5 мл 1%-ной взвеси эритро­цитов, пробирки встряхивают и вновь выдерживают смесь в контакте 30-60 минут. Параллельно ставят контроли:

а) контроль сыворотки на спонтанную агглютинацию: к 0,25 мл сы­воротки, в разведении 1:20 добавляют 0,25 мл физраствора и 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов (сыворотка не должна давать агглютинации);

б) контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию; к 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов добавляют 0,5 мл физраствора. Агглюти­нации не должно быть;

в) контроль реакции с нормальной сывороткой и антигеном - агг­лютинация должна быть. / СЦ

В положительных случаях при учете РЗГА будет отсутствовать аг­глютинация эритроцитов, в то время как этот же вирус без добавления сыворотки и с нормальной сывороткой будет вызывать четкую гемаг­глютинацию. С помощью РЗГА можно определить нарастание титра антител в процессе динамики болезни. Титром антител считается наи­высшее разведение сыворотки, которое задерживает проявление гемаг­глютинации.

С пары: компоненты: сыворотка (известная диагностическая положительная отрицательная\неизвестная исследуемая), антиген (берут в количестве 4 ГАЕ), однопроцентные эритроциты.

Цель постановки: идентификация вируса, титр антител и динамика их нарастания

Учет реакции: в первой пробирке, где больше всего сыворотки – эритроциты оседают на дно в виде пуговки; далее начинается агглютинация; в конце – зонтик.

Диагностика: чума плотоядных, гепатит плотоядных, псевдочума

Сущность, техника постановки и учет реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

В последние годы при диагностике вирусных болезней все шире вне­дряется РНГА(РПГА), которая более чувствительная, чем прямая РГА и является специфической серологической реакцией.

Целый ряд вирусов способны адсорбироваться на эритроцитах и при этом не вызывать их агглютинацию. Если же к таким эритроци­там, сенсибилизированным антигеном, т. е. несущим на себе адсорби­рованный вирус, добавить иммунную специфическую сыворотку про­исходит агглютинация эритроцитов с помощью антител иммунной сы­воротки.

В настоящее время при некоторых вирусных болезнях разрабаты­ваются и выпускаются предприятиями биопромышленности такие эритроцитарные диагностикумы. Эритроциты для лучшей адсорбции на них вируса (или антител) предварительно обрабатывают раство­ром таннина путем смешивания равных объемов 2,5% взвеси эритро­цитов и раствора таннина (1:200.000), затем центрифугируют и отмы­вают фосфатным буфером. На обработанные таннином эритроциты затем адсорбируют вирус и получают эритроцитарный антиген, кото­рый затем и используют для исследования сывороток крови на нали­чие антител. С целью выявления вируса в исследуемом материале и для его идентификации и типизации применяют эритроцитарный диагностикум, сенсибилизированный специфическими антителами, т. е. несущий на себе адсорбированные антитела.

Для постановки реакции в пробирки вносят по 0,5 мл соответству­ющего разведения исследуемой сыворотки (при исследовании на наличие антител) и 0,1 мл взвеси сенсибилизированных вирусом эритроцитов (эритроцитарный антиген). В качестве контролей ста­вят параллельно реакцию с положительной и нормальной сыворотка­ми и этим же эритроцитарным антигеном. Пробирки после встряхи­вания ставят в термостат или оставляют при комнатной температуре на 40-60 минут и учитывают результат. Если исследуемая сыворотка иммунная, т. е. содержит антитела, происходит агглютинация эритроцитов (положительная реакция, животное инфицировано). Эта реак­ция более перспективна, чем прямая, для диагностики вирусов, и особен­но тех, которые сами не обладают гемагглютинирующими свойствами.

Для выявления вируса в патологическом материале используют эритроцитарный диагностикум с адсорбированными антителами. Если в патматериале содержится вирус специфичный для антител, насту­пает агглютинация эритроцитов.

С пары: Компоненты: сыворотка и антигенный эритроцитарный диагностикум (получают на биокомбинатах, для получения используют эритроциты быка, барана, лошади, человека; нарабаотывают для вирусов, которые являются не гемагглютинирующими)

Сущность: берут эритроциты, обрабатывают раствором таннина, формалином, после проводят сенсибилизацию вирусов. Эритроцит меняет форму (становится с выпуклостями). Вирус прикрепляется к неровным частям эритроцита.и тд (выше)

Учет реакции: АТ много, вируса много – зонтик, в остальных пробирках менее выраженный зонтик. В конце пуговка.

Сущность, постановка и учет иммуноферментного анализа (ИФА).

Метод иммуноферментного анализа (ИФА). Метод ИФА ос­нован на использовании для диагностики антител меченых ферментами. Для метки применяют такие ферменты как пероксидазу хрена (Пероксидаза хрена (англ. Horseradish peroxidase, HRP) — фермент, выделенный из хрена, широко применяющийся в молекулярно-биологических методиках для усиления слабого сигнала до уровня, необходимого для детекции), щелоч­ную фосфатазу и др. Используют ИФА для выявления и идентификации как вируса, так и антител к нему.

Для идентификации вируса иммуноферментный тест применяют в двух вариантах: гистохимический и твердофазный. *.

Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазная реакция, аналогична методу иммунофлуоресцен^ии (МФА), но от­личается тем, что для постановки реакции используются антитела мече­ные не флуорохромом, а ферментом и учет реакции проводят просмот­ром под обычным световым микроскопом. В этом варианте ИФА используются антитела, меченые нероксидазой хрена. Выявляют вирусный антиген (вирусы) в мазках-отнечатках из органов, мазках крови, гистосрезах, культурах клеток зараженных вирусом. Ставят им- мунопероксидазную реакцию по прямому и непрямому варианту.

а) Для ^выявления вируса по прямому варианту используют мече­ные пероксидазой специфические вирусу антитела. Такие меченые антитела (конъюгаты) готовят в учреждениях биологической промыш­ленности.

Мазки-отпечатки из патматериала, культуры клеток, выращенные на покровных стеклах и зараженные вирусом, фиксируют при -10°, -20°С ацетоном, высушивают на воздухе и затем на мазок наносят иммуно- пероксидазный конъюгат в рабочем титре, инкубируют при 37°С во влажной камере 1-2 часа, 15 минут промывают физраствором, затем споласкивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Затем наносят несколько капель субстрата- это вещества, которые под действием ферментов разлагаются, образуя цветной про­дукт ферментативной реакции. Для пероксидазы хрена в качестве суб­страта применяют диаминобензидинтетрахлорид, 5-аминосалициловую кислоту, ортотолуидин, ортодимилендиамин. Чаще используют диаминобензидинтетрахлорид. Мазок с нанесенным субстратом инку­бируют 5-10 минут, промывают 10-15 минут физ раствором, споласки­вают дистиллированной водой. Учет результатов проводят под обычным световым микроскопом. В положительных случаях, т. е. при наличии антигена в мазках, после нанесения иммунопероксидазного конъюганта образуется комплекс «Аг + Ат», меченый ферментом. После нанесения на препарат субстрата последний под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментации, хорошо видимый в световом микроскопе. Образуется при разложении продукт реакции голубого цвета, который быстро переходит в коричневый и будут видны или равномерное диффузное желто-коричневое окрашивание или гранулы коричнево-черного цвета. В контроле окрашивания не будет. Также об­рабатывают и гистосрезы, но контакт конъюганта удлиняют до 6 часов.

б) При непрямом методе ИФА используют антивидовые иммунопероксидазные конъюгаты (антивидовые антитела меченые пероксидазой). На фиксированный охлажденным ацетоном препарат (мазок- отпечаток, мазок, гистосрез) наносят первоначально специфическую искомому антигену сыворотку, контактируют 1-2 часа во влажной ка­мере, промывают физраствором 5 минут, высушивают на воздухе, за­тем наносят антивидовой иммунопероксидазный конъюгат и инкуби­руют при 37°С 1-6 часов во алажной камере и далее как и при прямом методе. Учет проводят также под световым микроскопом.

Методы твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА) основаны на применении антител (или антигена) фикси­рованных на нерастворимых носителях. В качестве носителей исполь­зуют стеклянные или нейлоновые шарики, полистироловые или кера­мические пробирки и микропанели с плоским дном, латекс.

Применение ТФР1ФА используется как для обнаружения ви­русного антигена, так и для специфических антител. В этом мето­де используют меченые как пероксидазой хрена, так и щелочно-фосфатазные.

Для выявления вируса с помощью данного метода в вируссодержащем материале наиболее часто используют метод двойных антител или 4сэндвич». Для этого лунки полистироловых микропанелей сенсиби­лизируют гамма-глобулином, выделенным из специфической к иссле­дуемому антигену сыворотки. В лунки вносят по 0,2 мл гамма-глобу­лина в нужной концентрации в натрий-карбонатном буфере с рН-9.6,

инкубируют 1 час при 37°С и затем оставляют на ночь при 4°С. Наутро риз лунок сливают раствор гамма-глобулина, промывают лунки пане­ли 3 раза по 5 минут калий-фосфатным буфером с рН-7.4, затем в лун- ки вносят по 0,2 мл раствора, содержащий антиген, и инкубируют 2 часа при 37°С. В контрольные лунки вносят заведомо известный положительный и негативный антигены. Микропанели за­тем промывают 3 раза по 5 минут калий-фосфатным буфером. Затем в лунки вносят по 0.2 мл иммуноферментного конъюгата и инкубируют 1-2 часа при 37°С, промывают калий-фосфатным буфером 3 раза по 5 минут и вносят в лунки по 0.2 мл раствора субстрата (для иммуно- пероксидазного конъюгата применяют ортофенилендиамин или 5-ами- носалициловая кислота, а для щелочно-фосфатазного конъюгата р-нит- рофенилфосфат), инкубируют в темноте при комнатной температуре 5-30 минут. Реакцию останавливают добавлением 0,05 мл 2Н H2S04 (для пероксидазы) и ЗМ NaOH (для щелочной фосфатазы). Учиты­вают реакцию визуально по разности в окраске опытных и контрольных образцов. При использовании субстрата ортофенилендиамина поло­жительные образцы имеют оранжево-коричневую окраску, а при 5-ами- носалициловой кислоты опытные образцы окрашиваются в интенсив­но-коричневый цвет, контрольные образцы или неокрашенные, или слабо-желтые. При использовании щелочной фосфатазы опытные об­разцы окрашены в желтый цвет. Учет реакции ИФА можно проводить с помощью спектрофотометра.

Люминесцентная микроскопия в вирусологии. Метод флуорохромирования (МФ) и методы флуоресцирующих антител (МФА).

Среди новейших способов диагностики бактериальных и вирусных заболеваний особое место занимает люминесцентная (флуоресцент­ная) микроскопия. Повышенная чувствительность, цветное изображе­ние на темном нефлуоресцирующем фоне, возможность обнаружения телец-включений, некоторых крупных вирусов и риккетсий, простота и надежность - ценные качества этого вида микроскопии.

Особое значение люминесцентная микроскопия имеет при ускорен­ной диагностике инфекционных заболеваний, при ускоренной инди­кации возбудителя во внешней среде.

Результаты люминесцентной микроскопии являются довольно спе­цифичными и высокоточными. По данным ряда авторов этот метод не уступает по показаниям данным биопробы и другим методам, однако для люминесцентной микроскопии нужно иметь высококачественные специфические флуоресцирующие сыворотки или иммуноглобулины. Люминесцентная микроскопия в последние годы находит все большее применение и является одним из главных методов при диагностике многих вирусных болезней.

В люминесцентной микроскопии используется явление фотолюми­несценции, т. е. способность объекта светиться (издавать свечение) в момент облучения его ультрафиолетовыми лучами. Источниками та­ких лучей в люминесцентном микроскопе являются ргутно-кварцевые лампы. Для проведения микроскопии в настоящее время выпускаются люминесцентные микроскопы серии ЛЮМАМ, а также люминесцент­ные устройства, которые монтируются на обычный световой микроскоп, такие как ОИ-28 и другие. Результаты, получаемые при работе с лю­минесцентными устройствами, лишь незначительно уступают резуль­татам, получаемым при работе со специальными люминесцентными микроскопами. Как микроскопы люминесцентные, так и устройства должны быть хорошо настроены, комнату для работы затемняют. Для иммерсионной микроскопии при люминесцентном исследовании ис­пользуют специальное нефлуоресцирующее масло, заменители его (ди- метилфтолат ДЭТА) или просто дистиллированную воду при водной иммерсии. Настройку микроскопа или устройства проводят согласно прилагаемой к ним инструкции.

Объекты, рассматриваемые при люминесцентной микроскопии, мо­гут давать собственную люминесценцию (аутолюминесценция), как, например, грибки микроспории, и такие объекты смотрят без всякой дополнительной окраски. Однако большинство патогенных микроор­ганизмов и вирусы аутолюминесценцией не обладают, а поэтому маз­ки надо обрабатывать либо специальными красками (флуорохромы), либо мечеными (флуоресцирующими) антителами. В связи с этим все методы обработки мазков для люминесцентной микроскопии можно разделить на две группы:

1. Метод флуорохромирования (МФ).

2. Методы флуоресцирующих антител (МФА) или иммунофлуо- ресценция (ИФ).

а) Метод флуорохромирования. По своей технике этот метод принципиально почти ничем не отличается от методов обычной ок­раски мазков, применяемых при световой обычной микроскопии. Для этих целей используют также анилиновые красители, но краски берут такие, которые обладают явлением фотолюминесценции, т.е. светятся в момент облучения их ультрафиолетовыми лучами. Такие краски на­зываются флуорохромами, а окраска ими - метод флуорохромирования. К флуорохромам относят такие красители как акридин оранжевый и желтый, аурамин, корифосфин, родамин, трипафлавин, риванол, флуо- ресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) и другие. Продается специальный набор - «Набор красителей для флуоресцентной микроскопии», со­держащий 20 красителей. Растворяют флуорохромы в дистиллирован­ной воде (или буфере), к некоторым из них добавляют фенол до 5%. Разведения для большинства красителей обычно готовят 1:1000 (ак­ридин желтый 1:500, акридин оранжевый, родамин и корифосфин 1:10.000). Наибольший интерес здесь представляет акридин оранже­вый, который окрашивает ДНК в ярко светящийся желто-зеленый цвет, а РНК в оранжево-красный. Для исследований можно готовить мазки из патматериала, мазки-отпечатки, гистосрезы, зараженные культуры ткани, выращенные на покровных стеклах. Чтобы различить проис­хождение ДНК или РНК (клеточное или вирусное) препараты (маз­ки, мазки-отпечатки) обрабатывают 0,5%-ным раствором ДНК-азы или PIIK-азы в течение 5-10 минут. При этом свечение клеточных ДНК или РНК сразу же исчезает, а вирусные ДНК или РНК продолжают светиться еще 20-30 минут. Это служит доказательством специфично­сти вирусных нуклеиновых кислот.

Метод флуорохромирования широко применяется при диагности­ки бактериальных болезней и для этого имеются разработанные ВИЭВ рекомендации для окрашивания различных микробов и спор.