Биохимические свойства бактерий

Бактерии синтезируют разнообразные ферменты, принадлежащие к 6 классам. Ферментный состав любого микроба определяется его геномом и является довольно стабильным признаком. Поэтому определение сахаролитических, протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами и даже вариантами (биоварами) бактерий, имеет важное таксономическое значение для идентификации бактерий. Целый ряд ферментов (гиалуронидаза, коагулаза и других) способствуют проявлению патогенных свойств возбудителей, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека.

Одни ферменты локализуются в цитоплазме, цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве бактерий – эндоферменты, другие – экзоферменты, выделяются в окружающую среду. Функциональное значение экзоферментов связано с расщеплением макромолекул в окружающей среде до более простых соединений.

Ферменты могут функционировать независимо друг от друга или быть тесно связанными между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в строгой последовательности. Последние носят название – мультиферментные комплексы (ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране).

У бактерий различают три основные группы ферментов:

1. Конститутивные – постоянно синтезирующиеся в микробных клетках.

2. Индуцибелъные – синтез которых индуцируется соответствующим субстратом.

3. Репрессибельные – синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.

 

  Для идентификации микроорганизмов – возбудителей инфекционных болезней, кроме морфологических и культурных свойств, необходимо изучение биохимических признаков, к которым относят: сахаролитические, протеолитические свойства бактерий, пигменто – и токсинообразование.

Бактерии характеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы. Утилизация углеводов бактериями приводит к образованию органических кислот, либо кислот и газов.

 

Определение сахаролитических ферментов.

Бактерии ферментируют углеводы с образованием кислоты, а иногда кислоты и газа.

Выявление сахаролитических ферментов проводит на средах Гисса. состоящих из 1% пептонной воды. 0.5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, маннит и др.) и индикатора Андреде (кислый фуксин в растворе N аОН). В щелочной среде фуксин обесцвечен. Свежеприготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет. В пробирку со средой опускают поплавок (стеклянная трубочка один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов. Результаты посевов учитывают через 2 – 48 часов.

При расщеплении углеводов, вследствие образования кислоты, происходит сдвиг рН в кислую сторону. Цвет среды меняется. Среда Гисса приобретает малиново-красный цвет фуксина. Делают вывод о расщеплении данного углевода до кислоты. Например, глюкоза+ К. При расщеплении углеводов с образованием кислоты и газа отмечают изменение цвета среды и появление пузырька газа в поплавке. Например, лактоза+ К/Г (рисунок 29).

 

Отдельные бактерии продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты – протеазы, катализирующие расщепление белка

О протеолитической активности бактерий судят по способности расщеплять белок до газов: индола и сероводорода. Для этого исследуемую культуру засевают на МПБ. Между пробкой и горлышком пробирки укрепляют индикаторные бумажки. На сероводород – индикаторная бумажка пропитана уксуснокислым свинцом (при выделении Н₂S – чернеет), а на индол – индикаторная бумажка пропитана раствором щавелевой кислоты (при выделении индола – краснеет).

Также для определения протеолитических ферментов – коллагеназ производят посев уколом исследуемой культуры в столбик мясо–пептонной желатины (МПЖ). Продолжительность культивирования 7–10 суток при комнатной температуре. При положительном результате наблюдается разжижение желатины.

 

   

Рис. 29 Изучение сахаролитических свойств E. coli на средах Гисса

 

 

При микробиологической диагностике дифтерии производят посев выделенной чистой культуры бактерий на среду с мочевиной (для выявления уреазы) и среду с цистином (для обнаружения цистиназы).

 

При диагностике кишечных инфекций среда Клиглера для выявления ферментации глюкозы, лактозы испособности вырабатывать сероводород.

В настоящее время для изучения биохимических свойств бактерий используют системы индикаторные бумажные (СИБ) или мультимикротесты (ММТ).

СИБ – набор бумажных дисков или полосок, пропитанных различными субстратами и индикаторами. Диски, которые помещают в пробирки со взвесью изучаемой культуры, после инкубирования в термостате по изменению цвета диска, делают вывод о продукции фермента (рисунок 30).

При использования индикаторных полосок с помощью бактериальной петли наносят исследуемую культуру на полоску, при наличии соответствующего фермента наблюдают  изменение цвета.

 

 

Рис. 30 Системы индикаторные бумажные

 

ММТ представляют собой пластиковые планшеты, в лунках которых находятся различные субстраты с индикаторами, в которые вносят взвесь изучаемой культуры. После инкубирования в термостате по изменению или содержимого лунок судят о биохимических свойствах культуры (рисунок 31).

В настоящее время используют автоматические биохимические анализаторы (рисунок 32).

 

Рис. 31 Мультимикротесты                 Рис. 32. Автоматические биохимические

                                                        анализаторы.

 

Пигментообразование является стойким генетическим признаком микроба и наличие цвета используют для идентификации пигментообразующих бактерий. Для большинства патогенных бактерий пигментообразование не характерно. Белый, золотистый, лимонно-желтый пигмент образуют стафилококки; желтый, кремовый – микобактерии туберкулеза; сине – зеленый – синегнойная палочка.

Пигменты, как правило, защищают микробную клетку от ультрафиолетовой радиации (рисунок 33).

 

    Рис. 33 Пигментированные колонии

 

 

                                Ситуационные задачи

Задача 1.

   В бактериологическую лабораторию направлена мокрота больного, при бактериологическом исследовании выросли колонии морщинистые, сухие похожие на «цветную капусту» или «тутовую ягоду».

1. К какому типу относят данные колонии?

2. Возбудители какого заболевания образуют подобные колонии?

 

Задача 2.

В бактериологическую лабораторию доставлена отечная жидкость из раны больного с подозрением на газовую гангрену.

1. Укажите какой группе по типу дыхания относятся возбудители газовой гангрены?

2. Какие методы культивирования применяются для выращивания данных микробов?

 

Задача 3.

У больного пневмонией в мокроте обнаружены грамположительные кокки, располагающиеся скоплениями в виде «гроздьев винограда».

1. Какой микроорганизм имеет такие морфологические и тинкториальные свойства?

2. Какие питательные среды необходимо применять для выделения чистой культуры этого возбудителя?

3.В какую группу по типу дыхания относится данный микроорганизм?

4. Как провести выделение чистой культуры?

 

Задача 4.

В лабораторию доставлена мокрота от больного для подтверждения диагноза «туберкулез». При микроскопии мазков, окрашенных методом Циля-Нильсена, обнаружены красные тонкие палочки.

1. Какой метод выделения чистой культуры необходимо использовать в данном случае?

2. Каковы этапы выделения чистой культуры?

3. Как проверить чистоту выделенной культуры?

Задача 5.

У больного с гнойным уретритом при микроскопии отделяемого уретры обнаружены в большом количестве грамотрицательные и грамположительные кокки.

1. Какие исследования необходимо провести для идентификации выделенных бактерий и постановки диагноза?

 

Задача 6.

В бактериологическую лабораторию направлены для исследования испражнения больного с диагнозом – «острая кишечная инфекция».

1. На какие питательные среды необходимо посеять материал для выделения возбудителя и уточнения диагноза?

2. Какие свойства микроорганизма необходимо изучить?

 

Задача 7.

В инфекционную больницу поступил больной с подозрением на дизентерию. У него отмечалась высокая температура, частый жидкий стул с примесью крови и слизи. Для подтверждения диагноза были проведены бактериологические исследования.

1. Каковы методы забора материала от больного с острым кишечным заболеванием?

2. Какой метод лабораторной диагностики был использован в данном случае?

3. Какие мероприятия нужно провести в очаге кишечного заболевания после госпитализации больного?

 

Задача 8.

В бактериологической лаборатории произведен посев исследуемого материала в конденсационную жидкость скошенного мясо–пептонного агара. Через сутки культивирования на питательной среде обнаружен «ползучий» рост микроорганизмов.

1. С какими свойствами бактерий связан их «ползучий рост»?

2. Для какой цели может быть использовано изучение этой особенности роста бактерий на питательных средах?

3. Как называют данный метод культивирования бактерий?

Задача 9.

При посеве испражнений больного на среду Эндо, с последующей инкубацией в термостате, получен рост S-типа колоний, имеющих различные размеры и окраску. Одни колонии были крупные, красного цвета; другие – мелкие, бесцветные.

1. Одного ли вида микроорганизмы находились в исследуемом материале?

2. К какой группе сред относят указанную выше среду?

3. Назовите еще ряд питательных сред, применяемых для этих целей?

 

Задача 10

У больного предполагают брюшной тиф. При бактериологическом посеве крови больного из нее выделена чистая культура брюшнотифозных палочек.

1. Каковы этапы выделения чистой культуры?

2. Каковы морфологические и культуральные свойства возбудителя брюшного тифа?

  

 

Вопросы для самоконтроля

1. К какой группе бактерий по способу углеродного питания относят возбудителей бактериальных инфекций у человека?

2. Какие бактерии являются облигатными аэробами?

3. Могут ли факультативные анаэробы расти в присутствии О₂?

4. Возбудители каких заболеваний являются облигатными анаэробами?

5. Каково применение элективных сред?

6. Какие среды являются дифференциально-диагностическими?

7. Для чего используют среды Гисса?

8. Как проявляется рост бактерий на жидких питательных средах?

9. Как проявляется рост бактерий на плотных питательных средах?

10.  Какие среды используют для культивирования облигатных анаэробов?

12. Для выделения каких бактерий используют среду Левенштейна-Йенсена?

13. Какие свойства у колоний S-типа?

14. С какой целью применяют метод Дригальского?

15. Пигментообразование – это?

16. На каких средах выявляют сахаролитические ферменты?

17. На какой среде выявляют протеолитические ферменты?

18. Какие современные методы используют для изучения биохимических свойств бактерий?

 

 

Основная литература

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник / [В. В. Зверев и др.]; под ред.: В. В. Зверева, А. C. Быкова; М-во здравоохранения Рос. Федерации, Первый Моск. гос. ун-т им. И. М. Сеченова. – Москва: Медицинское информационное агентство, 2016. - 815 с.

2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: в 2 т. Том 1. [Электронный ресурс]: учебник / Под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.:ГЭОТАР-Медиа, 2016. – http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970436417.html

3. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2 т. Том 2. [Электронный ресурс]: учебник / Под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко - М.:ГЭОТАР-Медиа,2016. – http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970436424.html

4. Микробиология, вирусология: руководство к практическим занятиям [Электронный ресурс]: учеб. пособие / Зверев В.В. [и др.]; под ред. В.В. Зверева,М.Н.Бойченко-М.:ГЭОТАР-Медиа,2015.–360с. http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970434956.html

 

Дополнительная литература

1.Микробиология, вирусология и иммунология: руководство к лабораторным занятиям [Электронный ресурс]: учеб. пособие / под ред. В.Б. Сбойчакова, М.М.Карапаца.–М.:ГЭОТАР–Медиа,2015.–320с. http://www.studmedlib.ru/ru/book/ISBN9785970435755.html