Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Этап идентификации размноженного генетического материала ⇐ ПредыдущаяСтр 7 из 7
Собственно ПЦР на этом заканчивается и далее идет не менее значимый этап идентификации. Для идентификации используют метод электрофореза или меченые «затравки». При использовании электрофореза полученные нити ДНК разделяются по размерам, и наличие фрагментов ДНК разной длины свидетельствует о положительном результате анализа (то есть о наличии того или иного вируса, бактерии и т.д.). При использовании меченых «затравок», к конечному продукту реакции добавляют хромоген (краситель), вследствие чего ферментативная реакция сопровождается образованием окраски. Развитие окраски прямо свидетельствует, что вирус или другой выявляемый агент присутствуют в исходной пробе. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, который представляет собой специфическую амплификацию нуклеиновых кислот, индуцируемую синтетическими олигонуклеотидными праймерами in vitro. Идея разработки метода ПЦР принадлежит американскому исследователю Kary Mullis, который в 1983 г. создал метод, позволивший амплифицировать ДНК в ходе циклических удвоений с помощью фермента ДНК-полимеразы в искусственных условиях. Через несколько лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., К. Mullis получил за нее Нобелевскую премию. 64)компоненты реакции. Праймер. Амплификатор Компоненты полимеразной цепной реакции. Компоненты, используемые в ПЦР, следующие: Taq-ДНК-полимераза, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буферный раствор, «прямой» и «обратный» праймеры, а также ДНК-матрица. Фермент Taq-ДНК-полимераза. При оптимальных условиях в реакционной смеси ПЦР (50-100 мкл) фермент содержится в количестве 0,5-2 единиц на пробу. Taq-ДНК-полимераза синтезирует цепь ДНК до 1000 пар оснований в минуту. Увеличивая время полимеризации и подбирая новые разновидности ДНК-полимеразы, обладающие и экзонуклеазной (редактирующей) активностью, вырезающей ошибочные (некомплементарные) нуклеотиды, удалось получить очень длинные амплифицированные ДНК - до 42 тыс. пар оснований (Лонг-ПЦР). Избыток Таq-ДНК-полимеразы увеличивает образование неспецифических продуктов ПЦР.
Поскольку праймеры каждый раз встраиваются в амплифицируемые фрагменты ДНК-матрицы (амплификоны), то они должны в реакционной смеси ПЦР присутствовать в избытке, и концентрация их составляет 0,5-1 мкМ. Специфичность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется так называемой температурой отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя двухцепочечные структуры. Буферная система. 10-кратный буфер для ПЦР чаще всего имеет состав: 0,5 М KCl; 0,2 М Трис-HCl, pH 8,4; 25 мМ MgCl2; 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) - пример стандартной прописи буферной системыПраймеры Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка. После гибридизации матрицы с праймером (отжиг[13]), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже). Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица. Tm — температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером. Усредненная формула подсчета Tm для короткого олигонуклеотида (и для длинных фрагментов ДНК), с учётом концентрации ионов K+ и DMSO: ,[14] где L — количество нуклеотидов в праймере, K+ — молярная концентрация ионов калия, G+C — сумма всех гуанинов и цитозинов. В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C.
При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев: · GC-состав ~ 40—60 %; · близкие Tm праймеров (отличия не более, чем на 5 °C); · отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек[15] и димеров[16]; · желательно, чтобы на 3’-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы 65) какие заболевания можно диагностировать ПЦР методом С помощью методики диагностируют следующие заболевания:
ПЦР исследование при подозрении на заражение человека ВИЧ-инфекцией является едва ли не золотым стандартом. С его помощью удается обнаружить в организме этот опасный вирус, который приводит к сильнейшим изменениям в иммунной системе.
Выявить герпес с помощью этого подхода можно не только в стадии обострения, но и во время ремиссии заболевания. Что гораздо важнее, как говорят врачи, появляется также возможность точно определить генотип патогена. А значит и подобрать правильное лечение.
В это группу входят гонорея, микоплазмоз, уреаплазмоз, хламидиоз, трихомониаз и др. Список весьма обширен и включает в себя около 30 возбудителей. ПЦР методика постепенно вытесняет более классические методы, такие как микроскопия и посев. Объясняется это тем, что классические способы диагностики требуют большого количества времени. А оно может быть по-настоящему важным в лечении.
ПЦР на гепатиты позволило сделать настоящий прорыв в лечении этих опасных не только для здоровья, но и для жизни заболеваний. Сейчас без полимеразной реакции нельзя представить себе не только правильное определение вида вируса. Но и назначение адекватной терапии пациентам, столкнувшимся с этими вирусными болезнями.
ВПЧ - еще один распространенный вирус, который диагностируется с помощью цепной полимеризации. Причем часто важно не просто определить наличие вируса, но и установить, что это за штамм. Исследование играет роль для представительниц прекрасного пола. Дело в том, что многие женщины страдают от ВПЧ, некоторые штаммы которого могут способствовать формированию рака шейки матки. Только своевременная диагностика и принятие мер помогут в этом случае избежать беды.
Цитомегаловирусная инфекция, как и ВПЧ, распространена довольно широко. Наибольшую угрозу она представляет для беременных женщин. Так как способствует рождению ребенка с различными дефектами, иногда вплоть до летального исхода. На цитомегаловирус и антитела к нему проверяют многих беременных представительниц прекрасного пола.
Полимеразная цепная реакция в диагностике этой болезни играет не последнюю роль.
[1] https://newlab-med.ru/paczientam/poleznaya-informacziya/faktoryi,-vliyayushhie-na-rezultatyi-analizov.html
|
||||||
Последнее изменение этой страницы: 2021-09-26; просмотров: 128; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.134.81.206 (0.006 с.) |