Lac ja Trp operonid, nende reguleerimise sarnasused ja erinevused

Lac operon

Glükoosi olemasolul keskkonnas lacZYA geenid ei ekspresseeru. Kui glükoos puudub, aga leidub laktoosi, lülitatakse bakteritel need geenid sisse.

 

-   lac operonil on nõrk promootor (ei vasta konsensusjärjestusele), madala basaalse ekspressioonitasemega.

- CAP seostumissait (-60 bp). 

- CAP (Catabolite gene activator protein), positiivne regulaator (seostub DNAga ja cAMPga)

- Glükoos inhibeerib cAMP moodustumist.

- Glükoosi olemasolul on [cAMP] madal. Glükoosi ärakasutamisel [cAMP] tõuseb. Moodustub CAP-cAMP kompleks, mis seostub lac operonis oma spetsiifilise DNA järjestusega ja soodustab ekspressiooni.

 

Kui laktoos puudub keskkonnast, siis lacI repressor seostub operaatoriga, lacZYA ei ekspresseeru.

Kui laktoos on keskkonnas, siis repressor inaktiveeritud induktoriga seostumise tõttu, lacZ, lacY, ja lacA geenid ekspresseeruvad.

 

- LacZYA geenid on tavaliselt väga madalal tasemel ekspresseerunud 

- Laktoosi olemasolul seostub üks tema ainevahetuse produktidest repressoriga, inhibeerides selle

- Repressor ei seondu enam operaatoriga, ja lac ZYA geenid transkribeeritakse

- Repressoriga seostuja on induktor. 

- lacZYA RNA transkript on ebastabiilne ja lagundatakse ruttu. Seega, laktoosi lõppemisel või muu suhkruallika ilmumisel keskkonda taastub nende ensüümide ekspressiooni tavaline tase

 

Glükoos on keskkonnas, siis [cAMP] madal, CAP-cAMP ei moodustu ja lac operoni ekspressioon on madal.

Glükoos puudub, keskkonnas on laktoos CAP-cAMP moodustub, seostub DNAle ja tõstab lac operoni ekspressioonitaset

 

Trp-operon

- trp operon on konstitutiivne, ekspresseerub pidevalt.

- trp operon kodeerib Trp (aminohape trüptofaan) sünteesiraja 5 ensüümi

- trp repressor avaldub, kuid ei seostu ise operaatoriga. 

- Kui [Trp] on kõrgem kui rakul vaja, moodustab repressor kompleksi Trp-ga. See seostub operaatoriga, blokeerides ekspressiooni (ja Trp sünteesi). 

 

Cis-elemendid, trans-faktorid

Cis-acting elemendid – DNA järjestused, mis mõjutavad oma läheduses paikneva geeni ekspressiooni. Eri geenidel eri kombinatsioonid cis-elementidest

Trans-acting faktorid - transkriptsioonifaktorite seostudes teiste geenide cis-elementidega reguleerivad nende geenide ekspressiooni

DNA-valk interaktsioonid

• regulatsioon toimib läbi paljude cis-acting elementide ja trans-acting faktorite vaheliste seoste. 

· mitte-kovalentsed 

· DNAga seostumiseks võib valgul olla vajalik seostuda enne teise valguga (valk-valk interaktsioon)

 

Rekombinantse DNA metoodika alused

Rekombinantne DNA on soovikohaselt muudetud DNA järjestus.

Metoodika alused:

- E.coli rakkude transformatsioon võõrDNA-ga (ehk võõr-DNA viimine E.coli rakkudesse) – plasmiidid

- DNA molekulide lõikamine ja ühendamine - restriktaasid, ligaas

- analüüsimeetodid võõrDNA jälgimiseks - elektroforees, hübridiseerimine

                

Rekombinantse DNA loomise etapid:

1)  Täpselt määrata ‘doonorgeeni’ piirialad

2)  Lõigata välja valkude/ensüümidega e. “valguliste kääridega” või spets. ensüümide abil kopeerida vajalik jupp DNAd

3) Viia ‘’doonorgeen’’ teise DNA molekuli sisse, kasutades selleks looduslikke geneetilise info transportijaid- viiruseid ja baktereid

4) Viia rekombinantne geen, mis koosneb ‘’doonor’’ ja ‘’vastuvõtja” osast – märklaudrakku

 

 

Restriktaasid

Restriktaasid- restriktaasid on ensüümid, mia lõikavad kindla DNA järjestuse(äratundmiskoht) katki nii, et tekivad iseloomulikud otsad.

Äratundmiskohad on sageli palindroomsed, pikkusega 4-8 nt (AIAS SADAS SAIA)

 

Restriktaasidel on omadus lõikata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lõikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis-järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev.

Kasutades erinevaid restriktaase, võime saada DNA fragmente, millel on kas tömbid (Hpa I) või siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela juppe. Siduvate otsadega fragmente võib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita.

Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks – need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”.

Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. DNA ligaas sünteesib paardunud otste vahele fosfordiestersideme ehk ühendab.

Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA.

 

Plasmiidid

Bakteri tsütoplasmas on lisaks rõngaskromosoomile tihti mõned väiksemad DNA rõngad, need ongi plasmiidid. Põhiliselt on neil ainevahetuslik tähtsus. Plasmiidid sisaldavad geene, mis on vajalikud bakteri kasvukeskkonna eripärast tulenevate ensüümide sünteesiks. Need aitavad lagundada ümbritsevas keskkonnas leiduvaid orgaanilisi aineid. See on vajalik toitumiseks, aga ka elutegevuseks kahjulike ainete lagundamiseks või nende toime vältimiseks. Nt sisaldavad plasmiidid geene, mille põhjal sünteesitud valgud aitavad bakteritel antibiootikumi keskkonnas ellu jääda. Ühes rakus sisalduvate plasmiidide koguarv ja neis sisalduvate geenide arv ei ole püsiva suurusega, geenid liiguvad rõngaskromosoomist plasmiididesse ja tagasi.

 

Rekombinantse DNA puhul peab plasmiidil olema replikatsiooni origin, resistentsusmarkergeen (et oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata)

 

DNA kloneerimise etapid

DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena.

Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised:

1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide);

2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga;

3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine;

4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi

5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid.

6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest

 

42. DNA sekveneerimise – selle kohta Pata slaidides

DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine.

Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus, need saab siis tuvastada.

 

43. Polümeraasi ahelreaktsioon

See oli revolutsioon molekulaarbioloogias, sest võimaldab eksponentsiaalselt DNA-d paljundada.

 

PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes.

Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lõigu otste nukleotiidset järjestust.

Reaktsiooni käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset (väiksest arvust nukleotiididest koosnevat (8..30) praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplementaarse DNA ahela alguse nukleotiidsele järjestusele ja talitlevad kui ensüümi substraat, kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks.

PCR pôhietapid on järgmised:

1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikahelaks kôrge temperatuuriga (90-95 °C; 40-60 sek);

2) praimerite hübridiseerimine e. "istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks temperatuur viiakse alla ca 50 °C juurde 30 sekundiks ehk praimerite paardumine.

3) komplementaarse DNA ahela süntees DNA-polümeraasi toimel (72 °C juures aeg sôltub lôigu pikkusest, kuid ca 1-3 min). Ensüüm on termostabiilne ja on isoleeritud kuumavee allikates elavatest bakteritest (näit. Thermus aquaticus ja temalt saadud ensüümi nimetatakse TaqI).

Reaktsioonis kasutatavad komponendid (maatriks DNA, praimerid, ensüüm ja vabad nukkleotiidid- viiakse kohe algselt ühte katsutisse. Kuna ahelreaktsiooni etapid toimuvad erineva temperatuuri juures, siis on kogu protsess juhitav temperatuuri abil ja vastavaid tsükleid vôib korrata kümneid kordi. Igas tsüklis DNA hulk teoreetiliselt kahekordistub. Praktiliselt hilisemates tsüklites on reaktsiooni efektiivsus väiksem, kuna ensüümi aktiivsus langeb, samuti lôpevad otsa vabad nukleotiidid. Neid juurde pole aga vôimalik lisada. Saadud koopiate arv ulatub aga 30 tsükli järel juba miljonitesse, mis on rohkem kui küll olenematra, mis eesmärgil reaktsioon läbi viidi.

PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis.

PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA-molekul, mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis me selle ka avastame. PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel.

 

44.  Elektroforees – selle kohta ka Pata slaidides

Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile.

Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul.

 

Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log₁₀–ga tema massist (suurusest).

       1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid

                   2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt

                   3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile).

 

45. Nukleiinhapete hübridiseerimine

Kindla NA järjestuse tuvastamine NA molekulide segust kasutates komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist.

- Geelis lahutatud DNA/RNA kantakse üle (nailon)membraanile, nii et nad oleksid üksikahelad

-  Meid huvitav järjestus märgistatakse radioaktiivselt vm meetodil (proov)

- Lastakse üksikahelatel omavahel paarduda.       

- Mitteseostunud proov pestakse maha ja NA asukoht tuvastatakse märgise järgi.