Специальные методы микроскопии

В иммерсионном методе пространство между покровным стеклом и объективом микроскопа заполняют жидкостью, показатель преломления которой близок показателю преломления стекла (например, глицерин  или монобромнафталин ).

Если между покровным стеклом (пс) и объективом (о) находится воздух (в), то значительная часть световых лучей от некоторой точки препарата (пр) испытывает полное внутреннее отражение на границе стекло-воздух и не попадает в объектив (рис. 15.17). В случае иммерсии (и) лучи света от точки проходят по оптически однородной среде практически без преломления на границе двух сред, и апертурный угол увеличивается ().

 

Рис. 15.17

 

 

Фазовоконтрастный метод микроскопии используется для наблюдения малоконтрастных включений в препарате. Параллельные лучи света, проходя через препарат (п) (рис. 15.18), преломляются в линзе объектива (об) и достигают плоскости изображения (э) (например, луч 1). В заднем фокусе объектива помещается фазовая пластинка (ф), которая представляет собой слой прозрачного вещества в форме небольшого кружка определенной толщины и показателя преломления. Лучи, прошедшие фазовую пластинку, приобретают дополнительную разность хода.

Луч , претерпевший дифракцию на малоконтрастном включении и прошедший объектив, обходит фазовую пластинку и также достигает плоскости изображения.

Если разность хода между лучами 1 и  равна половине длины волны, то они погасят друг друга. В этом случае в окуляр микроскопа будет наблюдаться затемненное изображение малоконтрастных включений исследуемого объекта на светлом фоне.

 

Рис. 15.18

 

В методе темного поля для наблюдения используется специальный конденсор (к), в состав которого входит параболическое зеркало (рис. 15.19). В его фокусе находится исследуемый препарат (п). Диафрагма (д) служит препятствием для прямого попадания света на препарат. В то время как одни лучи, отразившиеся от зеркала, могут пройти через исследуемый объект и не попасть в объектив (об), другие лучи испытывают дифракцию на слабоконтрастных включениях в препарате, изменяют свое направление и попадают в объектив. В результате на темном фоне будут наблюдаться слабоконтрастные компоненты исследуемого предмета.

Глава 16

Взаимодействие света с веществом

Поглощение света

Поглощением света называется ослабление интенсивности света при прохождении через любое вещество вследствие превращения световой энергии в другие виды энергии (тепловую, фотохимическую и др.).

Закон поглощения был экспериментально открыт П. Бугером (1729) и заключается в следующем: в каждом слое одинаковой толщины поглощается одна и та же часть падающего светового потока (закон поглощения Бугера). Соответствующее математическое выражение имеет вид:

 

,

 

где I - интенсивность света, падающего на слой бесконечно малой толщины  (рис. 16.1),  - убыль интенсивности света после прохождения слоя,  - показатель поглощения (величина, показывающая, какая часть энергии падающего света поглощается слоем единичной толщины), .

Рис. 16.1

 

Если интенсивность света падающего на слой вещества толщиной l равна , то для интенсивности прошедшего света получаем

 

,

 

.

 

График изменения интенсивности света в зависимости от толщины l слоя вещества, через который проходит свет, представлен на рис. 16.2.

Рис. 16.2	Рис. 16. 3

Поглощение света обусловлено взаимодействием его квантов (фотонов) с атомами вещества. Рассмотрим некоторый слой вещества (рис. 16.3) толщиной  и площадью сечения S, на который падает световой поток. Объем слоя равен . Пусть n - концентрация атомов, поглотивших кванты света, s - малый элемент площади сечения, которую занимает один из таких атом, поглотивший квант. Тогда доля площади, в которой происходит поглощение квантов света атомами данного слоя,  в общей площади S равна:

 

.

 

Энергия световой волны пропорциональна среднему числу квантов, содержащихся в объеме слоя . Следовательно, доля поглощенных квантов равна относительному уменьшению интенсивности излучения :

 

.

 

Откуда после интегрирования получаем

 

.

 

В случае окрашенных растворов обычно пользуются молярной концентрацией , тогда произведение , где  - молярный показатель поглощения. Тогда закон поглощения принимает форму:

 (закона Бугера-Ламберта-Бера для окрашенных растворов).

В лабораторной практике данный закон выражают через показательную функцию с основанием 10:

 

,

где .

Пусть  - коэффициент пропускания света веществом. Введем оптическую плотность D раствора по следующей формуле:

 

.

 

Оптическая плотность удобна тем, что она линейно связана с концентрацией определяемого вещества. Метод определения концентрации вещества в окрашенном растворе называется фотоколориметрией.

Поглощение света следует отличать от его рассеяния. Рассеяние света - это явление, сопровождающееся изменением направления распространения света при прохождении через вещество и проявляющееся как несобственное свечение вещества. Согласно закону Рэлея (1899) интенсивность рассеянного света обратно пропорциональна четвертой степени длины волны.

 

Лазер

Лазер (оптический квантовый генератор) - это устройство, которое является генератором когерентных электромагнитных волн (видимого, инфракрасного и ультрафиолетового диапазонов) на основе вынужденного излучения атомов и молекул.

Основные элементы лазера (рис. 16.4):

1) активная среда как усилитель световой волны,

2) устройство для создания инверсии в активной среде (система накачки),

3) устройство обратной связи в виде системы зеркал.

 

Рис. 16.4

 

Рассмотрим два энергетических уровня  и  атомов среды, между которыми возможны следующие типы процессов:

а) спонтанное излучение - самопроизвольное испускание кванта электромагнитного излучения (фотона) в результате перехода с более высокого  энергетического уровня на более низкий  (рис. 16.5а);

б) поглощение - переходы с более низкого  на более высокий  уровень под действием излучения; они обуславливают поглощение излучения веществом (рис. 16.5б);

в) вынужденное (индуцированное) излучение - переходы с более высокого  энергетического уровня на более низкий , связанные с испусканием фотонов под действием излучения (рис. 16.5в). В результате взаимодействия возбужденного атома с фотоном, энергия которого равна энергии перехода , появляется два совершенно одинаковых фотона (с такой же частотой, фазой, поляризацией и направлением).

 

(а)	(б)	(в)
Рис. 16.5

 

 

Рассмотрим прохождение излучения через вещество. В обычных условиях имеет место ослабление пучка света, т.к. во взаимодействии излучения с веществом преобладают процессы поглощения (число атомов в основном состоянии больше, чем в возбужденном ). Если создать условия, при которых бóльшее число атомов находится в возбужденном состоянии  (т.н. инверсия населенности в среде), то интенсивность света будет увеличиваться за счет вынужденного излучения. Процесс создания инверсии населенности в среде называется накачкой. Например, в твердотельных лазерах в качестве системы накачки в основном используется лампа с мощным импульсным излучением.

Разберем схему генерации лазерного излучения по трехуровневой схеме (рис. 16.6). Под действием накачки электроны в атомах вещества с основного уровня  переходят в некоторое возбужденное состояние в полосе поглощения . В состоянии  электрон находится очень короткий промежуток времени (), после чего он самопроизвольно переходит на уровень  без излучения. Уровень  является метастабильным (сравнительно долгоживущий со временем жизни ). За счет этого создается инверсия населенности между уровнями  и . Лазерный переход с уровня  на уровень  происходит в результате вынужденного излучения фотонов с энергией .

В лазерных генераторах света необходимо наличие обратной связи, т.е. часть излученного света все время должна находиться в зоне активного вещества и вызывать вынужденное излучение все новых и новых атомов. Для этого активное вещество помещают между двумя зеркалами. В простейшем случае используется система из двух плоских параллельно расположенных зеркал, одно из которых полностью отражает падающий на него свет, а другое является полупрозрачным.

 

Рис. 16.6

 

 

Свойства лазерного излучения:

1) когерентность лазерного излучения; когерентное излучение состоит из волн, разность фаз которых остается постоянной во времени;

2) монохроматичность лазерного излучения; составляющие лазерного излучения очень мало отличаются по длине волны ;

3) высокая степень направленности лазерного излучения; расходимость лазерного пучка составляет 0,5-10 мрад;

4) высокая степень поляризации лазерного излучения;

5) высокая интенсивность лазерного излучения; излучение от лазера можно сфокусировать в область очень малого размера.

Лазеры, используемые в медицине, делятся на два вида: низкоинтенсивные или терапевтические () и высокоинтенсивные или хирургические ().

Воздействие низкоинтенсивных лазеров обусловлено фотобиоактивацией. Поглощая энергию кванта лазерного излучения, биологические молекулы оказываются в возбужденном состоянии и приобретают высокую реакционную способность. Это позволяет им более активно участвовать в разнообразных клеточных процессах.

Если излучение исходит от высокоинтенсивного сфокусированного лазера, то количество выделяющегося тепла велико, и в ткани возникает температурный градиент. В месте падения луча ткань испаряется, в прилегающих участках происходит обугливание и коагуляция. Такое фотоиспарение используют для послойного удаления или разрезания ткани. С помощью лазерной коагуляции завариваются сосуды и останавливается кровотечение.

Глава 17

Рентгеновское излучение

 

Физика рентгеновских лучей

Рентгеновские лучи - это электромагнитное излучение в диапазоне длин волн от  до 80 нм. В медицинской практике рентгеновское излучение с длиной волны  называется жестким, с  - мягким.

Рентгеновское излучение невидимо для глаза и наблюдается с помощью специальных фотопластинок или фотопленок; проникает через тела, непрозрачные для видимого излучения; обладает всеми свойствами электромагнитных волн (интерференцией, дифракцией, дисперсией и т.д.).

Рис. 17.1

 

Обычно в качестве источника рентгеновского излучения используют рентгеновскую трубку (рис. 17.1) - стеклянную вакуумную колбу с двумя электродами (анодом и катодом), между которыми создается высокое электрическое напряжение . Катод подключен к источнику низкого напряжения (напряжения накала). протекая по спирали катода электрического тока, он нагревается, и некоторые электроны получают дополнительную кинетическую энергию, достаточную, чтобы покинуть поверхность катода (термоэлектронная эмиссия). Оказываясь в электрическом поле между катодом и анодом, поток электронов разгоняется до больших скоростей, а затем резко тормозится и рассеивается полем атомов анода. Такое изменение траектории электронов означает, что у них появляется значительное ускорение, а любой ускоренно движущийся заряд излучает энергию в виде электромагнитных волн. В данном случае это электромагнитные волны рентгеновского диапазона. Рентгеновское излучение, возникающее подобным образом, получило название тормозного излучения.

Спектр тормозного излучения является непрерывным (сплошным), поскольку создающие его электроны обладают разной энергией. Следует отметить у спектра тормозного излучения наличие так называемой коротковолновой границы  (рис. 17.2). Существование коротковолновой границы спектра обусловлено тем, что энергия кванта излучения не может быть больше работы поля в трубке по разгону электрона . Знак равенства соответствует максимальной частоте излучения или минимальной длине волны, т.е. коротковолновой границе:

 

.

 

Чем больше ускоряющее напряжение U, тем меньше коротковолновая граница тормозного рентгеновского излучения  и тем более жестким оно становится.

Рис. 17.2

 

 

При больших значениях напряжения на трубке на фоне сплошного спектра 1 проявляются пики 2 характеристического излучения (рис. 17.3). Характеристическое рентгеновское излучение возникает, если сталкивающиеся с анодом электроны обладают энергией, достаточной для удаления электрона с внутренней орбитали атома вещества анода. При этом на указанную орбиталь может перейти электрон с внешней орбитали (рис. 17.4), отдав свою энергию в виде кванта рентгеновского излучения с энергией  и длиной волны:

 

.

 

Поскольку каждый атом обладает индивидуальным набором дискретных энергетических уровней, то и спектр характеристического излучения индивидуален для атомов того или иного химического излучения.

Зависимость частоты  характеристического излучения от атомного номера Z химического элемента вещества анода определяется законом Мозли:

 

,

 

где K - постоянная для данной спектральной линии.

Рис. 17.3	Рис. 17.4