Технологическая цепочка - Последовательность действий ПЦР

Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходят изменения, которые обеспечиваются температурными условиями реакции. Каждый цикл амплификации состоит из трех последовательных изменений температуры - этапов:

1. Денатурация 95 ^о С – обратимая денатурация - расплетание двухнитевой ДНК и превращение в однонитевую путем разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований противоположных цепей ДНК под воздействием высоких температур.

2.Отжиг 62-65 ^о С – это присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени.

Праймеры подбирают так, чтобы они ограничивали искомый фрагмент ДНК и были
комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии
с правилом комплементарности Чаргаффа. Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит.

3. Элонгация (синтез) 72 ^о С. После отжига праймеров Taq-полимераза начиначинает достраивание второй цепи ДНК с 3'-конца праймера с использованием дНТФ.

Температурный цикл амплификации многократно повторяется (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.

Эффект плато

Процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает – проявляется эффект плато.

Термин «эффект плато» используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3–1 пмоль.

КРИТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ПЦР

Температурный режим

Преактивация: Выдерживание реакционной смеси перед началом ПЦР в течении 0,5-10 минут при 92^оС позволяет инактивировать примесные белки и способствует более полной денатурации матричной ДНК

Выдерживание реакционной смеси в течении 5-10 минут при температуре 72^оС для полного завершения синтеза продуктов ПЦР

Количество циклов

Факторы уменьшающие скорость роста количества продукта ПЦР:

o Истощение субстрата (дНТФ или праймеров)

o Ингибирование ПЦР конечными продуктами реакции

o Конкуренция за субстрат со стороны неспецифичных продуктов реакции

o Неполная денатурации дцДНК

o Стабильность компонентов реакции

o «Изнашивание» ДНК-полимераз

o Увеличение вязкости реакционной смеси (препятствует элонгации праймеров)

Ионы двухвалентных металлов

Объем реакционной смеси

Матричные нуклеиновые кислоты

ПОЧЕМУ ЭТО ВАЖНО?

Неверный подбор условий и компонентов ПЦР приводит к образованию побочных продуктов реакции, «шмира», димеров праймеров, низкому выходу или полному отсутвию продуктов реакции.

ШМИР:

Неспецифические продукты ПЦР:

 

ЕСЛИ ВСЕ ПРАВИЛЬНО

 

ПЦР с обратной транскрипцией - история открытия и термины

Обратная транскрипция — это процесс образования двуцепочечной ДНК на основании информации в одноцепочечной РНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так как передача генетической информации при этом происходит в «обратном», относительно транскрипции, направлении.

Идея обратной транскрипции вначале была очень непопулярна, так как противоречила центральной догме молекулярной биологии, которая предполагала, что ДНК транскрибируется в РНК и далее транслируется в белки.

Однако в 1970 году Хауард Мартин Темин и Дейвид Балтимор, американские ученые, независимо друг от друга открыли фермент, названный обратной транскриптазой (ревертазой), и возможность обратной транскрипции была окончательно подтверждена. В 1975 году Темину и Балтимору была присуждена Нобелевская премия в области физиологии и медицины.

Обратная транскрипция является необходимым этапом жизненного цикла РНК-вирусов. Она позволяет перевести РНК-геном вируса в ДНК, с которой уже можно производить транскрипцию вирусных мРНК и новых геномных РНК.

Ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза — фермент (КФ 2.7.7.49), катализирующий синтез ДНК на матрице РНК в процессе, называемом обратной транскрипцией. Обладает активностью РНКазы Н (т.е. разрушает цепь РНК, входящую в состав ДНК/РНК-дуплекса). Подобно всем ДНК-полимеразам функционирует только при наличии затравки (праймера).

Денатурация или плавление - расхождение цепей ДНК при нагревании ДНК или при повышении pH. Расхождение цепей происходит из-за разрушения слабых водородных связей и плоскостных взаимодействий между основаниями.

Денатурация – процесс обратимый, последующее восстановление двухцепочечной структуры ДНК может происходить даже при полном расхождении цепей. Процесс воссоединения, называемый ренатурацией, реассоциацией или отжигом, происходит при понижении температуры или рН.

• При резком понижении температуры или рН правильное воссоединение комплементарных цепей затрудняется из-за спаривания оснований локально комплементарных участков в пределах одной или разных цепей.

• При ренатурации сначала соединяются участки цепей с повторенной ДНК и затем с уникальными участками

• Если совместно отжигают одноцепочечные ДНК, происходящие из различных источников, то формирование двухцепочечной структуры ДНК называют гибридизацией.