Правила преаналитического этап М-Б анализа

1) Для прямых методов диагностики инфекционных заболеваний важной особенностью является необходимость строгого соответствия места взятия биоматериала локализации процесса. В первую очередь это касается тех микроорганизмов, для которых известна тропность ко многим видам тканей, например:

1- основным видом биоматериала для лабораторного исследования на SARS-CoV-2 - является материал, полученный при заборе мазка из носоглотки и/или
ротоглотки. В качестве дополнительного материала для исследования могут
использоваться мокрота (при наличии), промывные воды бронхов,
полученные при фибробронхоскопии (бронхоальвеолярный лаваж),
(эндо)трахеальный, назофарингеальный аспират, биопсийный
или аутопсийный материал легких, цельная кровь, сыворотка, фекалии.

2-M. tuberculosis (обусловливает развитие внелегочных форм туберкулеза, в том числе: органов пищеварительной и мочеполовой систем; центральной нервной системы и мозговых оболочек; костей и суставов; кожи; глаз);

3-C. trachomatis (вызывает воспалительные заболевания экстрагенитальной локализации – воспалительные заболевания органов малого таза и брюшины, восходящий инфекционный процесс – поражения слизистой оболочки матки, труб, яичников, околоматочных связок).

2- Материал должен содержать максимальную концентрацию искомых микроорганизмов и должен быть лишен нежелательных примесей, ингибирующих ПЦР.

2) Хранение биологического материала - принципиальным для получения адекватных результатов ПЦР является хранение биологического материала. В настоящее время процессы взятия материала, его предварительная обработка, хранение и перевозка, передача исследуемого материала в другие организации осуществляются согласно методическим документам, регламентирующим выполнение исследований для каждого вида возбудителя инфекций, инструкциям к наборам реагентов и в соответствии с СП 1.2.036-95, СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08.

Пробоподготовка - МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Этапы молекулярно-биологического анализа:

Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики выделения в зависимости от поставленных клиницистами задач.

Задача №1 – обнаружение врожденных и наследственных заболеваний, поиск поломок/мутаций хромосомного материала при обследовании пациентов со злокачественными новообразованиями или лучевой болезнью. В этом случае необходимо тщательное исследование ДНК/РНК клеток пациента. Следовательно, методы выделения ДНК/РНК из клеток не должны повреждать саму молекулу ДНК/РНК.

Задача №2 – обнаружение инфекционных агентов, в этом случае ДНК клеток пациента – балласт, которого много, а НК инфекционных агентов мало, следовательно, можно использовать экспресс-методы.

Независимо от поставленных клиницистами задач, суть любого способа пробоподготовки заключается в экстракции (извлечении) нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) из исследуемого материала и удалении или нейтрализации посторонних примесей.

Пробоподготовка - Экспресс-методы

Экспресс-методы (используются для выделения ДНК) базируются на температурном лизисе клеток и последующем центрифугировании, в результате которого нерастворимые компоненты осаждаются на дне пробирки, а надосадочная жидкость (супернатант), содержащая ДНК, используется для проведения ПЦР.
Метод прост в использовании, занимает не более 10-15 минут, обеспечивает максимальный выход ДНК, но малоэффективен при работе с материалом, содержащим высокое количество примесей и ингибиторов ПЦР. Кроме того, метод не может быть использован для выделения РНК, так как РНКазы устойчивы к нагреванию.

Пробоподготовка - сорбентные методы

1. 2. Сорбентные методы выделения – дифференциальная сорбция нуклеиновых кислот (допустимо выделение как ДНК, так и РНК) на твердом носителе (чаще
всего: силикагель с повышенным отрицательным зарядом или модифицированной
поверхностью, стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и т. д.).
Нуклеиновая кислота обратимо связывается со стеклом в присутствии высокой концентрации хаотропных солей (например гуанидин тиоцианат). Ингибиторы и другие компоненты клинического материала остаются в растворе. Кроме хаотропных солей в лизирующем буфере чаще всего присутствуют детергенты, которые способствуют растворению и лизису белков. С помощью центрифугирования твердый носитель с НК осаждается, а супернатант c ингибиторами ПЦР удаляется. Серия последующих отмывок обеспечивает получение высокоочищенного препарата НК.
Актуальная на данный момент модификация сорбентного метода – выделение
на магнитных частицах в ручном или автоматическом режимах. Использование магнитных твердых носителей имеет ряд преимуществ по сравнению с немагнитными сепарационными методами.

В целом сорбентные методы обеспечивают высокую степень очистки НК, но могут быть сопряжены с потерями (особенно в случае низкого содержания
в образце – «низкокопийный образец») вследствие необратимой сорбции на носителе или в процессе нескольких промывок. Кроме того, остаточное количество сорбента в конечном растворе ДНК может ингибировать ферментативные реакции ПЦР.

Пробоподготовка - осаждение

3. Спиртовое осаждение (преципитация) – агрегация НК (как ДНК, так и РНК)
в присутствии соли и спирта. После осаждения спиртом НК отделяется от раствора
центрифугированием. Осадок, содержащий целевую НК, неоднократно промывается спиртами и концентрируется центрифугированием. На завершающем этапе процедуры происходит растворение НК в водном буфере, часто в процессе нагревания до 55–65 °С для лучшего растворения осадка.

Преимуществом данной технологии является возможность работы со «сложными» образцами, выделять в равной степени как ДНК, так и РНК, однако спиртовое осаждение приводит к преципитации не только НК, но и белков, что в свою очередь затрудняет получение чистого препарата. Наиболее простым путем решения проблемы с нежелательными примесями является уменьшение объема анализируемого образца, однако такой подход неприменим, если необходимо получить результат с максимальной чувствительностью.

ДНК является достаточно стабильной молекулой, медленнее разрушается под
действием ДНКаз, лучше сохраняется при транспортировке и хранении образца и допускает применение длительных методик выделения с использованием большой партии образцов. Напротив, РНК – нестабильный продукт, легко деградирует в условиях длительной транспортировки и хранения без дополнительной стабилизации в специальных средах. В условиях неавтоматизированных методик экстракции выделение нестабилизированной РНК лучше проводить небольшими партиями, исходя, например, из емкости имеющихся в ПЦР-лаборатории центрифуг, чтобы избежать деградации РНК в промежутках между этапами отмывок и центрифугирования.

Таким образом, к выбору метода подготовки пробы к ПЦР следует подходить с пониманием целей проведения предполагаемых анализов и особенностей материала для исследования.

Аналитический этап

Лабораторная диагностика молекулярно-биологическими методами, в том числе и ПЦР, в субъектах Российской Федерации может проводиться в лабораториях организаций, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение на работу с возбудителями III-IV группы патогенности с использованием методов диагностики, не предполагающих накопление возбудителя, соответствующие условия работы и обученный персонал. Эти правила не распространяются на возбудители I-II группы патогенности, для них есть свои правила, гораздо более жесткие.

Самый распространенный в ЛПУ на сегодня М-Б метод – ПЦР. В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных
мутаций, описаны десятки различных применений метода. Таким образом, открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (НК) в биологическом материале (пробе).