Молекулярная биология - комплекс биологических наук

Молекулярная биология - комплекс биологических наук

Молекулярная биология - комплекс биологических наук, изучающих механизмы хранения, передачи и реализации генетической информации, стро-ение и функции нерегулярных биополимеров (белков и нуклеиновых кислот).

В настоящее время с различной степенью точности расшифрована нуклеотидная последовательность геномной ДНК человека и микроорганизмов, причем около 300 видов микроорганизмов являются инфицирующими.

Расшифровка структуры генома человека показала, что в нашем геноме 32 000 генов, причем белок-кодирующих генов только 24 000, остальные гены кодируют РНК. Около 5% мутаций серьезным образом нарушают структуру и функции кодируемых белков и эти мутации связаны с тяжелыми моногенными болезнями человека.

Однако широко распространены в нашей популяции мутации, которые незначительно влияют на функции кодируемых белков. Эти мутации, получили название полиморфизмов и рассматриваются как варианты нормы. Но именно они формируют наследственную предрасположенность к наиболее частым мультифакторным болезням человека.

Словарь

Локус – от латинского слова «место» - место, занимаемое геном, генетическим маркером или SNP на хромосоме.

Локус, существующий в нескольких формах, называется полиморфным.

Аллель – мы наследуем по одному аллелю от каждого родителя, одна из форм локуса.

Определения:

Генетический полиморфизм (ГП) – это вариации генов у биологического вида. В классической генетике ГП соответствует вариантам, из которых наиболее редкий вариант встречается с частотой чаще, чем 1% (основан на диаллельной модели гена и множественном аллелизме). В молекулярном плане ГП – это нарушения структуры нуклеотидов в молекуле ДНК. Основная форма: однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) - изменения одной пары нуклеотидов, встречаются в 93% генов человека, в т.ч. качественный и количественный ГП.

В первом случае - это замена одного нуклеотида, или SNP (частота 1: 300 нп).

Во втором случае - это вариабельность числа тандемных повторов нуклеотидов, или STR (следуют друг за другом в виде одного, двух, трех и более повторов).

Если в повторе больше 10-100 нуклеотидов, то это ГП по размеру повторов, или VNTR. Кроме того, выделен аллельный ГП по числу копий повтора. Его причины: мутации, рекомбинации и неравный кроссинговер.

 

1957 год, Френсис Крик предложил путь передачи информации от ДНК к белку, но через РНК.

ДНК – полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков – нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счет дезоксирибозы и фосфатной группы (фосфодиэфирные связи). В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу.

В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином, гуанин – только с цитозином:

Репликация ДНК (редупликация, удвоение ДНК) — это процесс самоудвоения молекулы ДНК, осуществляемый под контролем ферментов. Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи-матрицы. Асимметричные концы цепи ДНК называются 3' (три-штрих) и 5' (пятьштрих). Полярность цепи играет важную роль при синтезе ДНК (удлинение цепи возможно только путем присоединения новых нуклеотидов к свободному 3'-концу).

РЕПЛИКАЦИОННАЯ ВИЛКА — точка, в которой цепи родительской двухцепочечной молекулы ДНК расходятся, для того чтобы могла происходить репликация.

Схема синтеза белка - транскрипция-трансляция

Аналитический этап

Лабораторная диагностика молекулярно-биологическими методами, в том числе и ПЦР, в субъектах Российской Федерации может проводиться в лабораториях организаций, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение на работу с возбудителями III-IV группы патогенности с использованием методов диагностики, не предполагающих накопление возбудителя, соответствующие условия работы и обученный персонал. Эти правила не распространяются на возбудители I-II группы патогенности, для них есть свои правила, гораздо более жесткие.

Самый распространенный в ЛПУ на сегодня М-Б метод – ПЦР. В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных
мутаций, описаны десятки различных применений метода. Таким образом, открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (НК) в биологическом материале (пробе).

КРИТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ПЦР

При практическом использовании ПЦР, по крайней мере, три характеристики данного метода важны для исследователя:

• Специфичность реакции – продуктом ПЦР должен быть именно тот локус ДНК, который амплифицировали, других продуктов от ПЦР быть не должно (при этом не обращают внимание на ошибочно включенные, в результате работы полимеразы, нуклеотиды);

• •Точность синтеза ДНК – ошибки в амплификафии недопустимы при определении первичной структуры аплифицированного локуса, или при использовании продукта ПЦР для синтеза кодируемого им белка в генно-инженерных системах экспресии;

• • • Эффективность синтеза ДНК – количественно оценивается по выходу продукта после окончании реакции. Теоретически через n циклов количество продуктов ПРЦ достигнет 2n-1 штук с каждой молекулы кДНК. Однако на практике такое происходит редко.

ДИЗАЙН ПРАЙМЕРОВ

В большинстве случаев необходимая длина праймеров составляет 18-30 нт, но для некоторых исследований применяют более длинные праймеры. Дизайн праймеров в настоящее время во многом облегчен благодаря специализированным компьютерным программам. Но ни одна из них не освобождает исследователя от необходимости мыслить при решении собственных задач.

1-Температура отжига праймера: ГЦ-состав праймера определяет температуру отжига праймера на кДНК и должен находится в пределах 35-65% (идеально 45-55%). Хотя состав праймера определяется первичной структурой кДНК, в случае если состав матрицы оказывается сильно смещенным в сторону А-Т или Г-Ц пар, допускается добавление к 5’-концу праймера нескольких Г-Ц или А-Т остатков, не комплементарных матрице. Для расчета температуры отжига праймеров используют следующую формулу: [4(Г+Ц)+2(А+Т)]-5^оС, при длине праймера ≤ 20 нт, или 62,5 + 0,41^оС(%Г-Ц) при длине праймера ≥ 20 нт.;

2-Желательно, чтобы температуры отжига пары праймеров для ПЦР совпадали, хотя допускается различие в 4-6^оС;

3-При выборе мест отжига праймеров на матрице необходимо избегать участков, которые в одноцепочечной форме образуют вторичную структуру;

4-Для эффективной ПЦР не требуется полной комлементарности матрице, хотя полное соответствие желательно. В связи с этим допускается присоединение к 5’-концам праймеров участков, заключающих сайты рестрикции, кодоны инициации и терминации транскрипции;

5-Включение Г или Ц остатков на 3’-конец праймера повышает вероятность неспецифичного отжига праймера на матрице;

6-Недопустима самокомлементарность праймеров, особенно в 3’-концевых областях, так как это приводит к образованию димеров праймеров и уменьшению их эффективности;

7-Ионные условия при проведении ПЦР должны подбираться индивидуально для каждой новой пары праймеров

8-Стандартные концентрации праймеров в реакционной смеси составляют 0,1-1 мкМ, увеличение концентрации обычно в большинстве случаев дает хорошие результаты, однако это делает дороже пробу.

Полимеразы

Методология ПЦР подразумевает использование термостабильных ДНК-полимераз.

Выбор конкретной полимеразы зависит от целей конкретного эксперимента.

ДНК-полимеразы, с более высокой точностью синтезирующие ДНК, как правило, обладают 3’ → 5’ экзонуклеазной активностью. Несмотря на высокую точность действия этих ферментов, только с ними не работают по ряду причин. Основная из них – неспецифический гидролиз праймеров, происходящий под действием корректирующей эндонуклеазы.

Использование Taq-полимеразы в смеси (50:1) с более корректно работающими ферментами позволяет уменьшить скорость деградации праймеров и значительно повысить точность синтеза ДНК.

Увеличение концентрации фермента в пробе приводит к увеличению вероятности появления в смеси неспецифический продуктов реакции

Эффект плато

Процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает – проявляется эффект плато.

Термин «эффект плато» используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3–1 пмоль.

КРИТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ПЦР

Температурный режим

Преактивация: Выдерживание реакционной смеси перед началом ПЦР в течении 0,5-10 минут при 92^оС позволяет инактивировать примесные белки и способствует более полной денатурации матричной ДНК

Выдерживание реакционной смеси в течении 5-10 минут при температуре 72^оС для полного завершения синтеза продуктов ПЦР

Количество циклов

Факторы уменьшающие скорость роста количества продукта ПЦР:

o Истощение субстрата (дНТФ или праймеров)

o Ингибирование ПЦР конечными продуктами реакции

o Конкуренция за субстрат со стороны неспецифичных продуктов реакции

o Неполная денатурации дцДНК

o Стабильность компонентов реакции

o «Изнашивание» ДНК-полимераз

o Увеличение вязкости реакционной смеси (препятствует элонгации праймеров)

Ионы двухвалентных металлов

Объем реакционной смеси

ПОЧЕМУ ЭТО ВАЖНО?

Неверный подбор условий и компонентов ПЦР приводит к образованию побочных продуктов реакции, «шмира», димеров праймеров, низкому выходу или полному отсутвию продуктов реакции.

ШМИР:

Неспецифические продукты ПЦР:

 

ЕСЛИ ВСЕ ПРАВИЛЬНО

 

ПЦР с обратной транскрипцией - история открытия и термины

Обратная транскрипция — это процесс образования двуцепочечной ДНК на основании информации в одноцепочечной РНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так как передача генетической информации при этом происходит в «обратном», относительно транскрипции, направлении.

Идея обратной транскрипции вначале была очень непопулярна, так как противоречила центральной догме молекулярной биологии, которая предполагала, что ДНК транскрибируется в РНК и далее транслируется в белки.

Однако в 1970 году Хауард Мартин Темин и Дейвид Балтимор, американские ученые, независимо друг от друга открыли фермент, названный обратной транскриптазой (ревертазой), и возможность обратной транскрипции была окончательно подтверждена. В 1975 году Темину и Балтимору была присуждена Нобелевская премия в области физиологии и медицины.

Обратная транскрипция является необходимым этапом жизненного цикла РНК-вирусов. Она позволяет перевести РНК-геном вируса в ДНК, с которой уже можно производить транскрипцию вирусных мРНК и новых геномных РНК.

Ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза — фермент (КФ 2.7.7.49), катализирующий синтез ДНК на матрице РНК в процессе, называемом обратной транскрипцией. Обладает активностью РНКазы Н (т.е. разрушает цепь РНК, входящую в состав ДНК/РНК-дуплекса). Подобно всем ДНК-полимеразам функционирует только при наличии затравки (праймера).

Денатурация или плавление - расхождение цепей ДНК при нагревании ДНК или при повышении pH. Расхождение цепей происходит из-за разрушения слабых водородных связей и плоскостных взаимодействий между основаниями.

Денатурация – процесс обратимый, последующее восстановление двухцепочечной структуры ДНК может происходить даже при полном расхождении цепей. Процесс воссоединения, называемый ренатурацией, реассоциацией или отжигом, происходит при понижении температуры или рН.

• При резком понижении температуры или рН правильное воссоединение комплементарных цепей затрудняется из-за спаривания оснований локально комплементарных участков в пределах одной или разных цепей.

• При ренатурации сначала соединяются участки цепей с повторенной ДНК и затем с уникальными участками

• Если совместно отжигают одноцепочечные ДНК, происходящие из различных источников, то формирование двухцепочечной структуры ДНК называют гибридизацией.

Оборудование

Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный амплификатор, отличительной особенностью которого является возможность возбуждать и детектировать флуоресценцию, отражающую накопление ампликонов, на каждом цикле амплификации.

Изотермальная ПЦР или LAMP

Разработан новый тест, в котором вместо ОТ-ПЦР используется технология петлевой изотермальной амплификации нуклеиновых кислот (LAMP - Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) of DNA or RNA (RT-LAMP) targets.). Поскольку реакция протекает при постоянной температуре, этот метод может дать положительные результаты всего за 5 минут и отрицательные результаты за 13 минут.

 

Цифровая ПЦР

Метод проведения ПЦР с регистрацией результатов в реальном времени (количественная ПЦР, qPCR, real-time PCR) для количественного определения фрагментов ДНК в образце прочно закрепился в практике лабораторных и научных исследований.

Современным альтернативным методом для решения подобных задач является цифровая ПЦР.

Молекулярная биология - комплекс биологических наук

Молекулярная биология - комплекс биологических наук, изучающих механизмы хранения, передачи и реализации генетической информации, стро-ение и функции нерегулярных биополимеров (белков и нуклеиновых кислот).

В настоящее время с различной степенью точности расшифрована нуклеотидная последовательность геномной ДНК человека и микроорганизмов, причем около 300 видов микроорганизмов являются инфицирующими.

Расшифровка структуры генома человека показала, что в нашем геноме 32 000 генов, причем белок-кодирующих генов только 24 000, остальные гены кодируют РНК. Около 5% мутаций серьезным образом нарушают структуру и функции кодируемых белков и эти мутации связаны с тяжелыми моногенными болезнями человека.

Однако широко распространены в нашей популяции мутации, которые незначительно влияют на функции кодируемых белков. Эти мутации, получили название полиморфизмов и рассматриваются как варианты нормы. Но именно они формируют наследственную предрасположенность к наиболее частым мультифакторным болезням человека.

Словарь

Локус – от латинского слова «место» - место, занимаемое геном, генетическим маркером или SNP на хромосоме.

Локус, существующий в нескольких формах, называется полиморфным.

Аллель – мы наследуем по одному аллелю от каждого родителя, одна из форм локуса.

Определения:

Генетический полиморфизм (ГП) – это вариации генов у биологического вида. В классической генетике ГП соответствует вариантам, из которых наиболее редкий вариант встречается с частотой чаще, чем 1% (основан на диаллельной модели гена и множественном аллелизме). В молекулярном плане ГП – это нарушения структуры нуклеотидов в молекуле ДНК. Основная форма: однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) - изменения одной пары нуклеотидов, встречаются в 93% генов человека, в т.ч. качественный и количественный ГП.

В первом случае - это замена одного нуклеотида, или SNP (частота 1: 300 нп).

Во втором случае - это вариабельность числа тандемных повторов нуклеотидов, или STR (следуют друг за другом в виде одного, двух, трех и более повторов).

Если в повторе больше 10-100 нуклеотидов, то это ГП по размеру повторов, или VNTR. Кроме того, выделен аллельный ГП по числу копий повтора. Его причины: мутации, рекомбинации и неравный кроссинговер.

 

1957 год, Френсис Крик предложил путь передачи информации от ДНК к белку, но через РНК.

ДНК – полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков – нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счет дезоксирибозы и фосфатной группы (фосфодиэфирные связи). В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу.

В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином, гуанин – только с цитозином:

Репликация ДНК (редупликация, удвоение ДНК) — это процесс самоудвоения молекулы ДНК, осуществляемый под контролем ферментов. Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи-матрицы. Асимметричные концы цепи ДНК называются 3' (три-штрих) и 5' (пятьштрих). Полярность цепи играет важную роль при синтезе ДНК (удлинение цепи возможно только путем присоединения новых нуклеотидов к свободному 3'-концу).

РЕПЛИКАЦИОННАЯ ВИЛКА — точка, в которой цепи родительской двухцепочечной молекулы ДНК расходятся, для того чтобы могла происходить репликация.

Схема синтеза белка - транскрипция-трансляция