Определение содержания хлоридов в плазме крови колориметрическим методом

Принцип метода

Хлорид-ионы освобождают из хлораниловокислой ртути (II) хлораниловую кислоту, содержание которой определяется фотометрически, количество хлораниловой кислоты пропорционально концентрации хлорид-ионов в пробе.

Проведение анализа

	Опыт, мкл	Контроль, мл
Плазма крови Стандартный раствор NaCl Раствор хлораниловокислой ртути	20 ‑ 2000	‑ 20 2000
	1 мин энергично встряхивают и инкубируют 10 минут
Эфир	2 капли	2 капли
	Перемешивают пробы и фильтруют через смоченные водой фильтры
Колориметрируют обе пробы против воды при длине волны 530 нм (зелёный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Расчёт

Количество хлорид-ионов в плазме крови рассчитывают по формуле

Содержание хлоридов [ммоль/л] =  ,

где: Е_ОП и Е_СТ ‑ оптическая плотность опытной и стандартной проб,
С_СТ ‑ концентрация хлоридов в стандартном растворе (100 ммоль/л).

Нормальные величины

Плазма крови                   94‑110 ммоль/л

Рассчитывают процентное соотношение концентрации хлорид ионов (К) в ротовой жидкости и концентрации хлорид-ионов в плазме крови.

К (%) = (С_РЖ / С_ПЛ) · 100 %,

где: С_РЖ ‑ концентрации хлоридов в ротовой жидкости (моль/л),
С_ПЛ ‑ концентрация хлоридов в плазме крови (ммоль/л).

Практическое значение

Ионы Сl^– являются основными внеклеточными анионами, присутствуют во всех жидкостях организма. Гиперхлоремия наблюдается при обезвоживании, вызванном недостаточным поступлением жидкости, при повышенном поступлении хлорида натрия, декомпенсации сердца, метаболическом ацидозе и респираторном алкалозе, снижении экскреции хлорид-ионов с мочой при нефритах, отравлении салицилатами, приёме глюкокортикоидов. Гипохлоремия встречается чаще и возникает при недостаточном поступлении хлоридов и избыточной потере через желудочно-кишечный тракт при заболеваниях, сопровождающихся неукротимой рвотой и поносом, при стенозе привратника, длительном потоотделении, почечном и сахарном диабете, сморщенной почке, в результате перераспределения и задержки хлоридов в повреждённых тканях при хронических воспалительных процессах, абсцессах, некрозах.

Оформление работы

Указывают принцип метода, регистрируют данные, делают расчёты, сравнивают полученные результаты с нормальными значениями показателя хлоридов в ротовой жидкости и плазме крови, делают выводы о наличии/отсутствии отклонений.

Задание

Провести сравнительную оценку полученных на лабораторных работах показателей содержания хлоридов, фосфатов, ионов кальция в крови с аналогичными показателями в слюне с целью охарактеризовать влияние минерального обмена организма на минеральный обмен в слюне. Предположить и обосновать пути и возможности гормональной регуляции минерального обмена слюны.

Лабораторная работа 5.
Обнаружение роданидов в ротовой жидкости

В ротовой жидкости содержатся роданиды (тиоцианаты), которые являются продуктом сульфирования цианидов (солей синильной кислоты) тиосульфатом натрия с помощью фермента роданазы:

КСN + Na₂S₂O₃  Na₂SO₃ + KSCN

Роданиды активируют пероксидазы слюны, участвующие в метаболизме пероксидов, и тем самым оказывать защитное действие. В гранулоцитах, поступающих в полость рта с жидкостью десневой борозды, локализован фермент лактопероксидаза, который окисляет имеющийся в слюне роданид с помощью перекиси водорода в бактерицидный гипотиоционат:

SCN^– + H₂O₂  OSCN^– + H₂O

Содержание роданидов в слюне зависит от контакта человека с табачным дымом. В слюне курильщиков их концентрация значительно больше по сравнению с таковой у некурящих. Высокие концентрации роданидов в ротовой жидкости вызывают токсические эффекты в пародонте.

Принцип метода

Роданиды в слюне обнаруживают по появлению красного окрашивания при добавлении к слюне хлорного железа. Реакция обусловлена образованием роданистой соли трехвалентного железа в результате взаимодействия ионов Fe³⁺ и SCN^– и образованием различных комплексов, имеющих состав от Fe(H₂O)₅(NCS)²⁺ до Fe(NCS)₆^3–. Некоторые органические соединения (например, соли лимонной и уксусной кислот) препятствуют образованию окраски.

Необходимые реактивы

1) 0,01 % раствор хлорного железа, 2) 2 % раствор соляной кислоты.

Материал для исследования

Слюна некурящего человека и курильщика.

Проведение анализа

Готовят две пробы: опытную (слюна курильщика) и контрольную (слюна некурящего человека). В каждую пробирку к 10 каплям слюны добавляют по 2 капли 2 % раствора соляной кислоты и по 2 капли раствора хлорного железа (FeCl₃). В результате появления роданида железа развивается красное окрашивание разной интенсивности в зависимости от концентрации ионов роданида.

Нормальные величины

Ротовая жидкость            0,5‑1,2 ммоль/л

                                            (визуально окраска не дифференцируется).

Практическое значение

Основным путём поступления лейкоцитов в полость рта является десневая бороздка и её жидкость. В местах повреждения слизистой оболочки полости рта происходит дополнительная эмиграция гранулоцитов из крови, которые принимают участие в защитных реакциях. Один из механизмов защиты основан на способности гранулоцитов к продукции гипотиоцианата. Гипотиоционат чрезвычайно бактерициден и совместно с пероксидом водорода и другими активными формами кислорода действует на микрофлору в полости рта (в том числе кариесогенную). Однако высокие концентрации роданидов оказывают токсическое влияние на пародонт, способствуя развитию воспалительных процессов.

Содержание роданидов (тиоцианатов) достаточно велико в слюне курильщиков (в 2‑10 раз выше, чем у некурящих людей), что связано с поступлением в их организм синильной кислоты, содержащейся в табачном дыме. Чем выше концентрация тиоцианатов в слюне, тем более заметной становится окраска.

Оформление работы

Указывают принцип метода, фиксируют результаты, сравнивают полученные у разных людей данные с нормальными величинами, делают вывод о наличии/отсутствии патологических отклонений и значении показателя.

Лабораторная работа 6.
Определение активности a–амилазы в слюне, плазме крови и моче

a-Амилаза (диастаза, 1,4–a–D–глюкангидролаза, КФ 3.2.1.1) катализирует гидролиз a–1,4–гликозидных связей крахмала до декстринов и мальтозы:

Крахмал + Н₂О  мальтоза + декстрины

a‑Амилаза тканеспецифична, её продуцируют слюнные железы и поджелудочная железа. Главная роль a‑амилазы в организме ‑ пищеварительная, поэтому фермент секретируется экзокринно, поступая, соответствен­но, в ротовую полость и просвет 12-пёрстной кишки. До 70 % фермента в полость рта секретируют околоушные железы. В результате естественного старения и отмирания клеток слюнных и поджелужочной желёз молекулы фермента попадают в кровь, поэтому в плазме крови всегда в небольшом количестве содержится a‑амилаза двух изоферментных типов: слюнной S‑тип (около 70 %) и панкреатический P‑тип (около 30 %). Фермент имеет относительно низкую молекулярную массу (около 48000 D), в связи с чем фильтруется в почечных клубочках и присутствует в моче. Соотношение изоферментов в моче иное, чем в крови: Р‑тип – 70 %, S‑тип – до 30 %. Хлориды и иодиды повышают активность фермента. При нарушении целостности железистых клеток, вырабатывающих a‑амилазу, процессам цитолиза сопутствует повышение концентрации и активности фермента в плазме крови и моче, что используют с целью диагностики заболеваний слюнных и поджелудочной желёз. В моче этот фермент традиционно называют «диастаза».

Энзиматический кинетический метод,
оптимизированный для биологических жидкостей

Принцип метода

a‑Амилаза катализирует реакцию гидролитического преобразования специфического углеводного субстрата, протекающую с отщеплением от олигосахарида 2‑хлор‑4‑нитрофенола:

2‑Cl‑4‑нитрофенил‑олигоCAX + Н₂О → 2‑Cl‑4‑нитрофенол + олигоCAX

Скорость образования 2‑хлор‑4‑нитрофенола пропорциональна активности фермента и определяется фотометрически.

Необходимые реактивы

Стандартный набор: 1) буферный раствор (0,05 М MFS‑буфер (pH 6,0) и 5 ммоль/л раствор хлористого кальция), 2) лиофилизированный субстрат. Для приготовления рабочего реагента, содержащего субстрат в концентрации 2,5 ммоль/л, содержимое флакона с субстратом растворяют в буфере при аккуратном перемешивании и оставляют на 3‑5 минут для стабилизации.

Материал для исследования

1) Ротовая жидкость (разведение 10‑50 раз), 2) сыворотка крови, 3) моча.

Проведение анализа

В кювете фотометра с длиной оптического пути 1 см смешивают рабочий реагент и исследуемую жидкость в соотношении 50:1 (рекомендуется использовать 3,5 мл рабочего реагента и 70 мкл сыворотки крови или разведённой слюны) и через 10 секунд измеряют оптическую плотность раствора (Е₀) при длине волны 405 нм против воздуха. Измерение повторяют точно (по секундомеру) через 1 мин (Е₁), 2 мин (Е₂), 3 мин (Е₃), не вынимая кювету из прибора.

Расчёт

Считают среднее значение изменения оптической плотности в минуту ΔЕ/мин.

ΔЕ/мин = [(Е₁ ‑ Е₀) + (Е₂ ‑ Е₁) + (Е₃ ‑ Е₂)]: 3

Расчёт активности a‑амилазы производят по одной из формул (в зависимости от того, в каких единицах необходимо представить активность фермента):

Активность a‑амилазы [Ед/л] = ΔЕ/мин · 3806

Активность a‑амилазы [нмоль/(с · л)] = ΔЕ/мин · 63446

Нормальные величины

Значения активности a‑амилазы в сыворотке зависят от температуры анализа:

при 25 °С ‑ до 120 Ед/л или до 2000 нмоль/(с · л)

при 30 °С ‑ до 160 Ед/л или до 2670 нмоль/(с · л)

при 37 °С ‑ до 220 Ед/л или до 3670 нмоль/(с · л)

Колориметрический метод определения активности амилазы

Принцип метода

a‑Амилаза катализирует гидролиз нерастворимого цветного крахмального субстрата с образованием синего, растворимого в воде красителя. Количество освобождённого красителя пропорционально каталитической активности энзима.

Необходимые реактивы

1) Фосфатный буфер pH=7,0, 2) крахмальный субстрат, 3) 9 ммоль/л раствор NaCl, 4) осаждающий раствор (1,85 ммоль/л раствор MgSO₄ и 2 ммоль/л раствор сульфосалициловой кислоты).

Материал для исследования

Свежая моча, сыворотка крови.

Проведение анализа

Готовят две опытных пробы (для свежей мочи и сыворотки крови), добавляя реагенты согласно приведенной ниже таблице, и далее обе обрабатывают одновременно.

Реагенты, мкл	Опыт 1	Опыт 2
Крахмальный субстрат	1000	1000
	Инкубируют при 37ºС 5 мин
Сыворотка крови	100	‑
Моча	‑	50
	Перемешивают, инкубируют при 37ºС точно 15 мин

В обе пробирки добавляют по 2,0 мл осаждающего раствора, тщательно перемешивают, через 15 мин уравновешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин (или фильтруют через слой ваты). Измеряют оптическую плотность опытных проб против воды при длине волны 590 нм (зелёный светофильтр) в кювете с длиной оптического пути 10 мм.

Нормальные величины

Сыворотка крови                      140‑350 Е/л,

Моча                                          1000‑2000 Е/л.

Расчёт

Активность α–амилазы в сыворотке и моче находят по приведённой ниже калибровочной таблице, исходя из полученной оптической плотности. Найденную по таблице каталитическую активность a‑амилазы мочи необходимо умножить на 2.

Если проба имеет высокую активность фермента, её разбавляют физиологическим раствором, снова проводят процедуру определения, полученный результат умножают на разведение.

Оптическая плотность	Активность фермента (Е/л)	Оптическая плотность	Активность фермента (Е/л)
0,046.........................40 0,068.........................60 0,089.........................80 0,110.......................100 0,120.......................110 0,130.......................120 0,150.......................140 0,170.......................160 0,190.......................180 0,210.......................200 0,229.......................220 0,259.......................250 0,288.......................280 0,307.......................300 0,354.......................350		0,402.......................400 0,449.......................450 0,495.......................500 0,501.......................550 0,587.......................600 0,679.......................700 0,769.......................800 0,859.......................900 0,948.....................1000 1,037.....................1100 1,125.....................1200 1,212.....................1300 1,473.....................1600 1,645.....................1800 1,816.....................2000

Определение активности амилазы мочи (метод Бюхнера)

Принцип метода

Основан на определении времени, необходимого для полного расщепления 2 мг крахмала амилазой исследуемой порции мочи.

Необходимые реактивы

1) Раствор Люголя (0,1 % раствор йода в 0,2 % растворе KJ), 2) 0,1 % раствор крахмала, 3) физиологический раствор (0,85 % раствор NaCl).

Проведение анализа

Отмеривают в пробирку 2,0 мл раствора крахмала, 1,0 мл физиологического раствора и помещают на 2 минуты в водяную баню при 37 °С. После прогревания в пробирку добавляют 0,5 мл мочи, перемешивают и отмечают время начала реакции. На предметные стёкла в 5‑6 местах наносят по капле раствора йода. Через каждые 3 минуты берут из пробирки исследуемую смесь и смешивают с очередной каплей йода. Инкубацию продолжают до тех пор, пока вместо сине‑фиолетового окрашивания не появится жёлтое, в этот момент гидролиз 2 мг крахмала можно считать законченным.

Расчёт

Активность α–амилазы рассчитывают по формуле:

Активность амилазы [усл.ед.] =   ,

где: 15 – время, необходимое для расщепления 2 мг крахмала (мин),
1 – условно принятая единица активности амилазы, при которой расщепляется 2 мг крахмала за 15 мин, Т – фактическое время
реакции (мин), 0,5 – количество мочи в реакционной смеси (мл).

Нормальные величины

Моча                                 1–2 усл. ед. (метод Бюхнера)

Практическое значение работы

Повышение активности фермента α‑амилазы происходит, главным образом, при воспалении и дегенеративных изменениях поджелудочной и слюнных желёз (например, при паротите ‑ воспалении колоушной железы). Особенно повышение выражено при остром некрозе поджелудочной железы, остром панкреатите, когда активность фермента в крови и моче возрастает в 10‑30 раз. В детском возрасте повышение наблюдается при эпидемическом паротите, что указывает на поражение вирусом паротита не только слюнных желёз, но и поджелудочной железы, иногда поражает поджелудочную железу вирус гриппа. Возрастание активности α‑амилазы выявляется при диабетическом кетоацидозе, беременности, почечной недостаточности, кишечной непроходимости, заболеваниях желчных путей, некоторых опухолях легких и яичников.

Оформление работы

Указывают принцип метода, регистрируют результаты, делают расчёты, сравнивают полученные данные с нормальными величинами, формулируют выводы о наличии/отсутствии патологических отклонений с учетом клинического значения определяемого показателя.

Лабораторная работа 7.
Определение буферной ёмкости слюны

Буферная ёмкость слюны – способность нейтрализовать кислоты и щёлочи – обычно расценивается как защитный механизм полости рта, функционирующий по принципу саморегуляции. Буферная ёмкость поддерживается бикарбонатной, белковой и фосфатной буферными системами слюны. Бикарбонаты обеспечивают 50‑80 % буферных свойств слюны, их концентрация возрастает прямо пропорционально увеличению скорости ее секреции. Белковая система считается второй по значению, фосфатная – третьей. Кроме буферных систем слюна содержит ряд веществ (мочевина, ксиолин), гидролиз которых ферментами микрофлоры сопровождается выработкой аммония (NH₄OH), оказывающего местное защелачивающее действие.

Буферная ёмкость слюны значительно варьирует и зависит от характера питания, времени суток, состояния желудочно‑кишечного тракта. С увеличением скорости слюноотделения рН слюны возрастает, поэтому днём значения рН выше, чем ночью. Буферная способность слюны является главным механизмом снижения кислотной нагрузки на поверхность зуба и очень важна в механизмах защиты от кариеса.

Принцип метода

Сила буферных систем определяется их буферной ёмкостью, т.е. количеством молей кислоты или основания, которое необходимо добавить к буферному раствору, чтобы сместить его активную реакцию на единицу. Для слюны наиболее важно определение буферной ёмкости в отношении кислых продуктов, для чего добавляют фиксированный объём раствора соляной кислоты.

Необходимые реактивы

1) 0,005 N раствор HCl, 2) 0,5 % раствор индикатора метилоранж.

Материал для исследования

Свежая слюна: нестимулированная и стимулированная.

Проведение анализа

Оценивают слюноотделение (количество выделяемой слюны в единицу времени) путём сиалометрии. Объём слюны измеряют специальным сиалометром или мерными цилиндрами на 10 мл, откалиброванными с точностью 0,1 мл. При сборе слюны в цилиндры удобно использовать воронки. Слюну собирают натощак или через 1,5‑2,0 ч после еды. Сбор слюны проводят в течение 2 мин: а) в состоянии покоя ‑ нестимулированная слюна, б) при стимулировании ‑ стимулированная слюна (на занятии сбор производят у разных студентов, в качестве стимулирующего агента используют парафин, лимон или лимонную кислоту). Для получения достоверных результатов процедуру повторяют трижды и вычисляют среднее значение.

Проведение сиалометрии совмещают с анализом буферной ёмкости: к 01, мл слюны постепенно добавляют 3,0 мл 0,005 N раствора HCl и более.

Расчёт

На основе полученных данных вычисляют скорость слюноотделения в мл/мин. Рассчитывают буферную ёмкость 1 мл слюны.

Нормальные величины

Средняя скорость выделения слюны:

состояние покоя        0,3‑0,4 мл/мин (границы колебаний широкие, перекрытие может быть 20‑30‑кратным);

стимуляция                   возрастание скорости (стимуляция парафином увеличивает показатель до 1‑2 мл/мин).

Буферная ёмкость слюны:

норма ‑ 5‑7, пограничный уровень ‑ 4‑4,5,
низкий уровень ‑ меньше 4.

Практическое значение работы

Особенное значение буферная ёмкость смешанной слюны приобретает при определении риска возникновения кариеса.

Оформление работы

Указывают принцип метода, фиксируют результаты, сравнивают полученные у разных людей данные с нормальными величинами, делают вывод о наличии/отсутствии патологических отклонений, отмечают клиническое значение показателей.

Лабораторная работа 8.
Оценка обеспеченности организма витамином С
по его содержанию в моче

Аскорбат (витамин С) является водорастворимым витамином, не синтезируется в организме, излишки его выводятся с мочой. При недостатке в пище аскорбата развивается цинга, когда дефект соединительной ткани приводит к ломкости сосудов, кровоточивости дёсен, поражению кожи и деструкции в тканях пародонта (особенно в периодонтальной связке), что сопровождается расшатыванием и выпадением зубов. Витамин С при синтезе коллагена обеспечивает гидроксилирование аминокислотных остатков пролина под действием пролилгидроксилазы. В условиях дефицита аскорбата вновь синтезированный коллаген получается недогидрокси­лированным и не способен к образованию полноценных волокон. Витамин С и ионы Fe²⁺ являются кофакторами пролилгидроксилазы; выступая донором Н⁺, аскорбат поддерживает восстановленное состояние Fe²⁺ в активном центре фермента, предохраняя его от инактивации.

Наряду с синтезом коллагена витамин С стимулирует синтез гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфата, необходимых для формирования матрикса соединительной ткани. Участие витамина С в окислительно-восстановительных реакциях используется в антиоксидантной защите. Аскорбат активно тратится при развитии воспалительных и инфекционных заболеваний (в том числе тканей полости рта) для защиты от токсинов и последствий активации перекисного окисления липидов и белков.

Принцип метода

Аскорбиновая кислота, содержащаяся в биологических пробах, восстанавливает 2,6‑дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ). Концентрацию витамина С определяют по количеству затраченного на титрование красителя. Как только весь витамин в пробе окислится, титруемый раствор приобретает розовую окраску за счёт наличия в кислой среде недиссоциированных молекул ДХФИФ.

Необходимые реактивы

1) 0,1 % раствор ДХФИФ (краска Тильманса), 2) 2 % раствор HСl.

Материал для исследования

Свежая моча.

Проведение анализа

В колбу отмеривают 5 мл мочи и 5 мл дистил. воды, перемешивают, добавляют 2,5 мл 2 % раствора HCl. Титруют краской Тильманса до розоватого цвета, сохраняющегося 30 сек. Регистрируют объём краски, пошедший на титрование.

Расчёт

Содержание аскорбиновой кислоты (мг) в суточном объёме мочи рассчитывают по формуле:

где: 0,088 ‑ количество витамина С, соответствующее 1 мл 0,088 моль/л раствора ДХФИФ (мг); А – количество краски Тильманса, затраченной на титрование (мл); Б – среднесуточный объём мочи (мужчины 1500 мл, женщины 1200 мл); В – объём мочи, взятый для титрования (мл).

Нормальные величины

Моча                       20‑30 мг/сут или 113,55‑170,33 мкмоль/сут.

Практическое значение

Метод используют в клинике для диагностики недостаточности витамина С. Определение содержания витамина С в моче даёт представление об его запасах в организме, так как концентрация аскорбата в крови соответствует его количеству, выделяемому с мочой. Однако при гиповитаминозе содержание аскорбата в моче не всегда понижено, часто оно бывает в норме на фоне недостатка витамина в тканях и органах, что усугубляет гиповитаминоз. Уровень аскорбата снижается при острых и хронических инфекционных заболеваниях, а также при цинге, что сопровождается поражением периодонта, кровоточивостью дёсен.

У здоровых людей введение per os 100 мг витамина С быстро приводит к повышению его концентрации в крови и моче. При гиповитаминозе С ткани, испытывающие недостаток в витамине, задерживают принятый аскорбат, и его концентрация в моче не повышается.

Определение содержания витамина С
в растительном материале

Материал для исследования

Картофель, плоды шиповника, лук, свежая и квашеная капуста, морковь.

Проведение анализа

Исследуемый продукт

Навеска г

H2O для экстрак-ции, мл

Вид фильтра

Общий объём экстракта, V1

Экстракт (мл) для анализа, V2

Аскорбат, мг