Методы идентификации клонов, содержащих рекомбинантные молекулы

В большинстве экспериментов по молекулярному клонированию в результате действия рестриктаз полу- чается сложная смесь фрагментов ДНК. Существуют специальные приемы, позволяющие отобрать клоны,

содержащие рекомбинантные молекулы ДНК. Напри- мер, при использовании фазмид, дают урожай исклю- чительно фаговые частицы, в головки которых паку- ются рекомбинантные молекулы. При применении плазмид отбирают клоны с рекомбинантными ДНК по инактивации одного из маркеров вектора и т. д. Сле- дующая, более трудная задача состоит в том, чтобы найти среди рекомбинантов клон, несущий нужный исследователю ген.

Методы скрининга рекомбинантных клонов мо- гут быть основаны на изменении фенотипа клет- ки под влиянием вновь синтезированного продукта рекомбинантного гена, либо на свойствах самого продукта. Одним из таких приемов является тест на комплементацию, который применяется в том слу- чае, когда клонируемый ген обеспечивает комплемен- тацию мутаций генома клетки, например, ее переход из ауксотрофного в прототрофное состояние. При этом гибрид может быть обнаружен простым отбо- ром на селективной среде.

Если продукт гена, т. е. белок, вырабатывается в достаточных количествах, возможен отбор нужного клона иммунологическим методом. Метод прямой ра- диоиммунологической детекции колоний заключается в следующем. Колонии клеток лизируют на поверх- ности агара, затем отпечатывают на поливиниловую пластинку, на которой адсорбированы антитела к бел- ку искомого гена. Далее эту пластинку обрабатывают антителами, меченными I125. Так образуется комплекс белка-антигена с двумя молекулами антител, одна из которых присоединена к пластинке, а другая мече- на йодом. Образование комплекса тестируется радио- автографически. Метод очень чувствителен и дает по- ложительный ответ при наличии в клетке всего одной или нескольких молекул белка.

При отсутствии экспрессии гена в клетках реци- пиента клоны могут быть идентифицированы по пер- вичной структуре ДНК или по характеру белка, синте- зированного в подходящей системе (ооциты лягушки, бесклеточные экстракты). Тестирование первичной структуры ДНК осуществляется гибридизацией с ме- ченой мРНК.

Используя метод гибридизационной селекции, денатурируют плавлением клонированную ДНК, им- мобилизуют ее на твердой поверхности и гибриди- зуют с мРНК. Дуплекс ДНК — РНК нагревают для освобождения мРНК, которую затем добавляют в бес- клеточную белок синтезирующую систему или вводят в ооциты лягушки для трансляции. Продукты транс- ляции идентифицируют по биологической активности или иммунологическим методам.

Если известна первичная структура гена или ко- дируемого им белка, для скрининга клонов можно ис- пользовать синтетические олигонуклеотиды — зон- ды, комплементарные искомому гену. Зонды имеют радиоактивную метку, которая позволяет обнаружить

их присутствие при связывании с искомым фрагмен- том ДНК.

 

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия — это важный раздел но- вой биотехнологии, объектами манипулирования ко- торой являются культуры клеток растений, животных, человека, а также клетки микроорганизмов. Культуры клеток высших организмов могут быть использованы для производства вакцин, моноклональных антител и других иммунологических препаратов, регуляторов роста при выведении новых сортов растений. Полу- чение протопластов дает возможность конструировать генетически новые объекты путем клеточной гибри- дизации или вводить в них чужеродный генетический материал.

Протопласты — это структуры, которые обра- зуются после полного удаления клеточной стенки. Неполное удаление клеточной стенки приводит к об- разованию сферопластов. В клеточной инженерии ис- пользуют как протопласты, так и сферопласты. Однако в ряде случаев эксперименты со сферопластами ока- зываются менее эффективными, чем с протопластами. Трансформация протопластов является универ- сальным способом введения молекул ДНК в клетки

бактерий, актиномицетов, дрожжей и грибов.

С помощью слияния протопластов можно полу- чать генетические рекомбинанты у тех видов микро- организмов, которые в естественных условиях никогда не скрещиваются между собой. Таким образом воз- можно получение гибридных форм у микроорганиз- мов, имеющих важное значение для микробиологиче- ской промышленности, что создает предпосылки для их генетического изучения и расширяет возможность для селекционной работы. Метод слияния протопла- стов позволяет объединить в одном геноме мутации, положительно влияющие на продуктивность и полу- ченные в разных селекционных линиях, в том числе и такие, которые трудно или даже невозможно инду- цировать в одной и той же клетке, а также избавляться от вредных мутаций.

Метод слияния протопластов как способ генетиче- ского обмена отличается от конъюгации, трансдукции и трансформации, при которых в реципиентную клет- ку попадает лишь часть ДНК донора, тем, что при сли- янии протопластов объединяются целые геномы и все компоненты цитоплазмы родительских клеток. Кроме того в акте слияния могут участвовать более двух про- топластов разных штаммов и в результате сразу полу- чаются рекомбинанты, несущие признаки всех роди- телей.

Для получения протопластов у микроорганизмов (протопластирования) используют несколько методов. Одни из них основаны на подавлении синтеза клеточ- ной стенки. Для бактерий используют вещества, нару-

шающие образование муреина: пенициллин, фосфо- мицин, высокие концентрации аминокислот глицина, метионина, треонина и др.; для дрожжей — 2-дезокси- глюкозу, аналог глюкозы, препятствующий образова- нию у них клеточной стенки.

Вторая группа методов включает ферментатив- ный лизис клеточной стенки. Лизоцим, гидролизую- щий муреин, используют для получения протопластов у бактерий, часто в сочетании с другими ферментами (протеазами, липазами) и ЭDТА (этилендиаминтетра- ацетатом). Для протопластирования мицелиальных грибов и дрожжей применяют литические ферменты из актиномицетов, грибов или пищеварительный сок виноградной улитки — (геликазу), который содержит несколько десятков различных ферментов. Использу- ют также смеси, состоящие из геликазы, целлюлазы, хитиназы, пектиназы и других ферментов.

Можно подвергать ферментной обработке клетки, выращенные на среде с ингибитором синтеза клеточ- ной стенки.

Протопласты являются осмотически хрупкими структурами. Поэтому всю работу с протопластами проводят в гипертонических растворах с осмотиче- скими стабилизаторами в концентрации 0,2-0,5 моль. Осмотическими стабилизаторами могут служить ми- неральные соли (KCl, NaCl, NH4 Cl, NaNO3), соли ор-

ганических кислот (сукцинат натрия),  многоатомные

спирты (маннитол, сорбитол), углеводы (сахароза,

рамноза, ксилоза и др.).

Образование и сохранение протопластов зависят от температуры, рН среды, концентрации литическо- го фермента и времени инкубирования с ним, возраста и фазы роста протопластируемой культуры.

В генетическом аппарате протопластов содержит- ся вся информация, необходимая для восстановления (регенерации) клеточной стенки и для возвращения их (реверсии) к клеточной форме с характерной мор- фологией. Процесс реверсии также зависит от соста- ва среды, температуры, рН, присутствия витаминов, микроэлементов, белков-протекторов (желатин, белки сыворотки крови). Для регенерации клеточной стенки необходим контакт протопластов с каким-либо под- держивающим каркасом, поэтому регенерацию прово- дят не в жидких средах, а на питательном агаре.

Эффективным индуктором слияния протопластов является полиэтиленгликоль (ПЭГ). Поверхность кле- ток и протопластов заряжена отрицательно и окруже- на водным слоем. Действие ПЭГ заключается в сни- жении поверхностного заряда и удалении воды, что создает условия для тесного контакта и слипания мем- бран. В местах слипания происходит разрыв мембран и содержимое двух соседних протопластов объединя- ется. ПЭГ — универсальный агент, вызывающий сли- яние протопластов различных видов микроорганизмов и обеспечивающий их трансформацию и трансфек- цию. Чаще всего применяют полимер со средней моле-

3

кулярной массой 1000-600 Да в концентрации 30-50% (масса/объем). При этом осмотические стабилизато- ры можно не использовать, поскольку их функцию выполняет сам ПЭГ. Слияние подавляется высокими концентрациями ионов Na+, K+, Cl–, NO – и небольши- ми примесями EDTA. Слияние протопластов идет уже при 4°С и эффективность его увеличивается при по- вышении температуры до 30°С. Центрифугирование повышает частоту слияния.

В опыты по слиянию протопластов берут генети- чески маркированные штаммы, часто несущие мута- ции ауксотрофности и устойчивости к антибиотикам. Продукты слияния — фузанты (от англ. fusion — слия- ние) отбирают на селективных средах.

Протопластирование и регенерация протопла- стов могут приводить к утрате плазмид, хромосомным перестройкам и мутациям, среди которых могут быть и полезные.

Глава 11. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

МИКРООРГАНИЗМОВ

В ПРОИЗВОДСТВЕ МЕДИЦИНСКИХ ПРЕПАРАТОВ И В ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

 

Микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности широко используются для диагностики, лечения и преду- преждения заболеваний. Помимо вакцин, иммунных сы- вороток и антибиотиков многие другие препараты давно вошли в медицинскую практику. Производятся и раз- рабатываются новые биологически активные вещества с использованием рекомбинантных штаммов микроорга- низмов, полученных методами гентической инженерии (гл. 8, 9). Микроорганизмы используют в аналитических целях при определении мутагенной активности химиче- ских веществ, витаминов, аминокислот и т.п. Они слу- жат моделью для испытания влияния на метаболизм не- которых фармацевтических продуктов.