Сущность, методика постановки и учета реакции нейтрализации и биопроба по типу РН.

РН – это реакция, осонованная на способности АТ нейтролизовать ядовитые свойства токсинов и вирусов.

Способ постановки:

1. Постановка РН на лабораторных животных при токсигенных инфекциях

2. Постановка РН на культуре клеток, куриных эмбрионах при вирусных инфекциях

3. Постановка РН для титрования анатоксина и антитоксической сыворотки

Постановка РН in vivo на лабораторных животных. Готовят взвеси сывороток и АГ, которые вводят лабораторным животным. Критерием служит гибель животного в контроле, зараженного этим вирусом.

Постановка РН на культурах клеток и куриных эмбрионах. Идентификацию вируса проводят по цитоплазматическим изменениям на культуре клеток,а на куриныхэмбрионахвыявляют морфологические изменения на хорион-аллантоистных оболочках.

Реакция флокуляции. Экзотоксины продуцируют многие виды микробов. Лечение и профилактика таких инфекций осуществляется с помощью анатоксических сывороток и анатоксинов. РН используют для титрования анатоксина и антитоксической сыворотки.

Иммунолюминесцентный метод: сущность, направления, способы постановки и учета, диагностическое значение.

Иммунофлюоресцентный анализ. Это реакция, в которой используют меченные флюорохромными красителями иммунные сыворотки. Их получают имммуннизацией животных соответствующими АГ, затем химически соединяют со светящимися красителями.

Способ постановки:

1.прямой метод

2.непрямой метод, метод Куиса

При прямом методе из исследуемого материала готовят препарат – мазок, обработанный флюоресцирующей сывороткой, содержащие АТ с искомому АГ. Мазок изучают в люминесцетном микроскопе.

При положительной реакции наблюдается свечение флюоресцирующего красителя, как результат взаимодействия АГ+АТ

Непрямой метод. Мазок с известной культурой обрабатывают сывороткой больного, а затем антиглобулиновой сывороткой, меченной флюорохромом.

При положительной реакции наблюдается свечение. ИЛ метод позволяет быстро выявить, как бактериальную инфекцию больного, так и выявить АТ в сыворотке крови больного. Используют для выявления хламидийной инфекции.

 

ВОПРОС 29.

Сущность реакции связывания комплемента (РСК) и её значение в диагностике вирусных болезней животных.      

Реакция связывания комплемента (РСК) за­ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комп­лексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным. Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорб­цией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связыва­ния комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О. Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), кото­рая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и AT соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемоли­за не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.

Комплемент – это сложный комплекс, входящий в состав сыворотки крови всех млекопитающих. Но больше всего комплемента в сыворотках крови морской свинки и человека (0-группа). Комплемент обладает следующими свойствами: легко разрушается под действием тепла и света (t 56 °С полностью разрушает комплемент за 30 мин);  адсорбируется на любом комплексе антиген – антитело независимо от его природы; его присутствие необходимо для протекания некоторых серологических реакций (в частности для лизиса эритроцитов барана сывороткой кролика, иммунизированного эритроцитами барана).

Реакцию ставят в два этапа. Сначала в пробирки наливают равные объемы антигена, сыворотки и комплемента. Полученные смеси выдерживают либо 30 мин при 37 °С, либо 18–20 ч при 4 °С. Если в сыворотке имеются антитела, гомологичные взятому антигену, образуется комплекс антиген + антитело и на нем адсорбируется присутствующий в смеси комплемент, а свободный в этом случае исчезает из смеси. Если же в сыворотке нет антител, гомологичных взятому антигену, комплекс антиген + антитело не образуется и в смеси остается свободный комплемент. На втором этапе РСК устанавливают, остается ли свободный комплемент или он исчез. К 3-компонентным смесям дополнительно добавляют равные объемы гемолизина кроликов, 3 %-й суспензии эритроцитов барана и вторично выдерживают при 37 °С 15–20 мин.

Результаты РСК оценивают в процентах гемолиза или в крестах. Для обнаружения в биоматериале антигенов определенного вируса с помощью РСК готовят суспензию этого материала, разливают ее по пробиркам и добавляют равные объемы сыворотки крови, содержащей антитела к предполагаемому вирусу. Затем в каждую пробирку доливают такие же объемы комплемента в разведениях (обычно с коэффициентом разведения 1, 2). Смеси выдерживают 18–20 ч при 4 °С, добавляют гемолитическую систему и после 20 мин нагревания при 37 °С учитывают результат. Параллельно ставят со всеми дозами 20 комплемента контроля с нормальными сывороткой, антигеном и контроли всех антигенов. Если окажется, что хотя бы с одной дозой комплемента РСК в опыте будет положительной, а во всех контролях отрицательной, то это указывает на наличие в биоматериале антигена, гомологичного антителам сыворотки. В такой модификации РСК достаточно чувствительна, но выявляет антигены не только истинно специфические для данной сыворотки, но и родственные им, то есть чувствительность РСК здесь групповая.

 Рис. 1 Схема РСК с сывороткой больного

 Рис. 2 Схема РСК с сывороткой здорового

Применение. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи­лиса (реакция Вассермана). Также РСК применяют для идентификации вирусов, например, для определения типа и варианта вируса ящура. Реакцию связывания комплемента ставят с двукратными разведениями стандартных сывороток (содержащих антитела к определенным вирусам) и исследуемым вирусом, используемым в качестве антигена. Сыворотки берут с одинаковыми титрами антител. Гомологичной для исследуемого вируса признают ту сыворотку, которая дает положительную РСК в наиболее высоком разведении. Постановка реакции в значительной степени осложняется необходимостью предварительного титрования практически всех ее компонентов. При необходимости ознакомиться с деталями техники идентификации вирусов в РСК рекомендуется проработать, например, инструкцию по типированию вируса ящура.

 

ВОПРОС 30.

Сущность реакции гемадсорбции (РГАд) и задержки гемадсорбции (РЗГАд)

Гемадсорбция – это прикрепление эритроцитов крови к поверхности зараженных клеток; наблюдают при добавлении в испытуемую культуру клеток эритроцитов того вида животных, которые агглютинируются вирусом, присутствующим в зараженных клетках.

Реакция гемадсорбции (Ргад) ставится на культурах ткани при некоторых вирусных болезнях с целью обнаружения вируса в клетках зараженных культур ткани на ранних стадиях размножения вируса, то есть до появления цитопатогенного действия (ЦПД). По своей сущности эта реакция не является серологической и основана на способности зараженных вирусом клеток культуры ткани адсорбировать на себе эритроциты.

Для постановки РГад используют зараженные вирусом культуры ткани в пробирках. В пробирки с культурой ткани, зараженной вирусом, не удаляя поддерживающую среду, вносят 0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов. После этого пробирки оставляют в наклонном положении под углом в 7-10° на 10-15 минут и по истечению этого времени просматривают под микроскопом. При постановке реакции во втором варианте из пробирок с зараженной культурой ткани предварительно сливают культуральную жидкость, затем вносят 0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов, пробирки оставляют в наклонном положении на 10-15 минут, затем культуру ткани промывают физиологическим раствором (осторожно ополаскивают и сливают) и смотрят под микроскопом.

При положительной реакции эритроциты адсорбируются на зараженных клетках и хорошо видны в форме гроздьев, розеток или беспорядочных скоплений. Если клетки не инфицированы вирусом, то на них эритроциты не адсорбируются и свободно плавают в культуральной жидкости (в первом варианте) или смываются при промывании физраствором и не видны (во втором варианте).

Реакция задержки гемадсорбции. В основе этой серологической реакции задержки гемадсорбции (РЗГад) лежит способность специфической иммунной сыворотки нейтрализовать гемадсорбирующие свойства клеток культуры ткани, зараженных вирусом. С помощью РЗГад можно идентифицировать вирус по известной иммунной сыворотке или выявлять антитела в исследуемых сыворотках крови по известному антигену (вирусу).

Для постановки реакции из зараженных пробирок с культурой ткани сливают поддерживающую среду и культуру ткани промывают ополаскиванием раствором Хенкса, затем в пробирки вносят по 0,2 мл специфической иммунной сыворотки и 0,8 мл раствора Хенкса (в контрольные пробирки вносят только раствор Хенкса без добавления сыворотки). Сыворотку с зараженной культурой ткани вылеживают в термостате или при комнатной температуре 40-60 минут и затем в пробирки вносят по 0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов, оставляют на 10-15 минут и просматривают под микроскопом.

При положительной реакции эритроциты свободно плавают в по­ле зрения. Это обусловлено тем, что гемадсорбирующая способ­ность вируса нейтрализована антителами специфической сыво­ротки. При отрицательной реакции происходит адсорбция эритроцитов на поверхности клеток.

 

ВОПРОС 31.