Понятие о культуре клеток. Их классификация и практическое применение.

Под культурой ткани и клеток понимают кусочки органов и тканей или отдельные их клетки, которые сохраняют жизнедеятельность и способность размножаться в питательной среде вне организма.

Для роста и размножения клеток вне организма необходим комплекс физико-химических факторов (оптимальная температура, осмотическое давление среды, газовая среда, солевой состав питательной среды, присутствие в среде ионов Na, K, Ca, Mg, Cl, карбонатов и фосфатов, pH 7.2……7.4, аминокислоты, глюкоза, витамины группы В, чистота и стабильность компонентов).

Культуры тканей различают в зависимости от условий выращивания клеток:

1. Культуры переживающих тканей в жидкой среде и на агаре, которые или вообще не размножаются in vitro, или дают очень слабый рост, т.е. в них отсутствует процесс размножения клеток. Заражение вирусом производят в момент их приготовления.

2. Культуры растущих тканей или клеток, активно размножающиеся in vitro при благоприятных условиях питания.

Используют, главным образом, 3 типа клеток:

1. Первичная культура – происходящая от клеток тканей или организмов, взятых непосредственно из организма. Культура считается первичной, пока ее не субкультивируют, после чего она становится клеточной линией. В ряде случаев первичная культура обладает более высокой чувствительностью к вирусам, по сравнению с клеточными линиями.

Приготовление первичных культур клеток включает: получение ткани, выделение клеток, выращивание однослойной культуры.

2. Линия клеток – первичная культура со времени получения субкультуры. Могут иметь ограниченный срок жизни in vitro, а могут размножаться неограниченно долго (становятся непрерывными клеточными линиями).

Линия диплоидных клеток. Морфологически однородная популяция клеток. Такие культуры часто называют штаммами. Штамм клеток – популяция однородных клеток, сохраняющая специфические свойства в течение ограниченного периода культивирования. Для нее характерны:

- стабильность в процессе культивирования in vitro;

- по крайней мере 75% клеток обладает кариотипом нормальных клеток исходного вида;

- ограниченный срок жизни;

- наличие фаз стабилизации, активного роста и старения;

- сохранение в процессе пассирования содержания каротина на уровне исходной ткани;

- на всем протяжении культивирования сохраняется доброкачественный характер;

- свободны от микоплазм и скрытых вирусов;

- обладают широким спектром чувствительности к вирусам, что позволяет выращивать в них большинство видов вирусов.

Линия гетероплоидных клеток. Клеточная линия имеет менее 75% клеток с диплоидным набором хромосом.

3. Постоянная (непрерывная) клеточная линия. Клетки способны к размножению вне организма неопределенно длительное время. Широко распространен термин «перевиваемые клетки».

Преимущества перевиваемых клеток:

- независимость от источников тканей, так как клетки пересеваются бесконечно;

- на клетки не влияют большие концентрации антибиотиков;

- соответствие стандартному состоянию.

Недостатки:

 - безграничный рост – свойство опухолевых клеток;

- быстрое наступление деструктивных изменений;

- при длительном культивировании часто подвергаются изменчивости.

Существенный недостаток тканевых культур, осложняющий их применение в вирусологической диагностике – частое загрязнение исходного тканевого материала латентными вирусами, микоплазмами.

 

ВОПРОС 23.

Цитопагенное действие (ЦПД) или цитопатический эффект (ЦПЭ) и гемадсорбция.

Обнаружить вирус в клетках можно по цитопатическому действию или цитопатическому эффекту.

ЦПД – это любые изменения клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Проявляются в виде многообразных функциональных, биохимических и структурных изменений. Функциональные и биохимические изменения в клетке возникают вскоре после инфицирования клетки вирусом. Они заключаются в угнетении процессов деления клеток, синтеза клеточных нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и белков, а на более поздних стадиях инфекционных процесса — в полном прекращении синтетических процессов (в клетке прекращается собственный метаболизм).

Для обнаружения ЦПД зараженные культуры клеток просматривают под малым увеличением светового микроскопа.

Наиболее существенно различаются три формы ЦПД:

1. Фрагментация. Разрушение клеток на отдельные фрагменты (вирус везикулярного стоматита).

2. Округление. Клетки принимают шаровидную форму и отделяются от стекла (аденовирусы).

3. Симпластообразование. Образование гигантских клеток: цитоплазма соседних клеток сливается вследствие растворения клеточных оболочек и образуется одна большая клетка со многими ядрами (вирус чумы КРС).

 

Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.

Используется только для индикации вирусов, содержащих гемагглютинины.

В пробирки с зараженным вирусом культурой ткани вносят 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубации и вида вируса. Учет реакции производят под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них после 1-2 кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образуют характерные скопления.

 

ВОПРОС 24.