Проведите сравнительный анализ получения вышеуказанных витаминов с помощью биотехнологии, принимая во внимание:

· биообъекты, которые используют в каждом конкретном случае;

· получение суперпродуцентов рибофлавина и витамина В,2,

· преимущества биотехнологического производства витаминов.

Ответ:

Известно, что высокой биологической активностью часто обладают не

сами витамины, а их производные - коферменты. Например, для рибофлавина характерно функционирование в двух коэнзимных формах: флавиномононуклеотида и флавинадениндинуклеотида. Активным продуцентом рибофлавина является культура дрожжеподобного гриба Eremotheciumashbyii и Ashbyagossipii. Сверхсинтеза рибофлавина достигают при использовании мутагенов для нарушения механизма ретроингибирования у продуцентов. Одновременно для активного биосинтеза целевого продукта в питательную среду вносят соевую муку или кукурузный экстракт, сахарозу, карбонат кальция, хлорид натрия, витамины. Кроме того, методами генной инженерии получен рекомбинантный штамм-продуцент (Bacillussubtilis) с повышенной устойчивостью к экзогенной контаминации.

Продуцентом витамина В12* являются пропионовые бактерии, продуктивность которых резко повышается при добавлении в среду предшественника витамина В|2* - 5, 6-диметилбензинзимидазола – и использовании мутантных штаммов. Если 5,6-диметилбензимида-зол не добавлять, то вместо витамина В12* синтезируется фактор В (кобинамид) и псевдовитамин В12, которые не обладают терапевтическим эффектом. Продуцентом кофермента НАД являются пекарские дрожжи. Выход НАД значительно увеличивается при добавлении в среду предшественников (аденина и никотинамида). Кроме того, можно повысить проницаемость мембран, обрабатывая клетки микроорганизмов ПАВ (поверхностно-активными веществами), например цетилсульфатом натрия и др.

При производстве аскорбиновой кислоты используют биотрансформацию D-сорбита в L-сорбозу уксуснокислыми бактериями. В качестве промышленного источника эргостерина*7 применяют дрожжи Saccharomycescerevisae.

Получение (β-каротина* возможно микробиологическими методами, однако при этом нужно использовать дорогие среды сложного состава, поэтому более рентабельным является химический синтез.

Преимущества использования биотехнологических методов при производстве витаминов:

- возможность селекции высокоактивных штаммов с применением генной инженерии;

- высокий уровень ферментации;

- применение иммобилизации клеток;

- утилизация отходов, снижение себестоимости и экологичность.

Задача 20.

Аминокислоты известны как составные элементы белков. Биологически активными являются толькоL-стереоизомеры аминокислот. Чистые L-аминокислоты находят свое применение в медицине в качестве или самостоятельных лечебных препаратов (L-метионин), или в составе смесей для парентерального питания, и в фармацевтической промышленности при синтезе различных ЛС. Используют их и как добавки при коррекции питания. Аминокислоты получают различными способами: биологическим, химическим, химико-энзи-матическим, микробиологическим. В настоящее время аминокислоты как ЛС завоевали себе определенный и довольно значительный сегмент от общего объема фармацевтической продукции.

С учетом представленной информации проведите сравнительный анализ:

· предложенных методов получения аминокислот на конкретных производствах;

· выбора микроорганизмов-биообъектов для создания штаммов-суперпродуцентов;

· особенностей подбора питательных сред с учетом ферментативной регуляции биосинтеза на клеточном уровне.

Ответ:

При получении аминокислот применяют различные методы.

Биологический метод (гидролиз белоксодержащих субстратов) наиболее дешевый. Однако существуют ограничения по стандартизации и по источникам сырья. Также из-за проблемы чистоты препаратов необходима многоступенчатая химическая очистка с частичным разрушением целевых продуктов (триптофан, треонин, серии, цистеин и др.).

Химический синтез: образуется смесь D и L-изомеров, тогда как биологически активными являются только L-изомеры аминокислот. Такое производство дорого, небезопасно и неэкологично.

Тем не менее производство аминоуксусной кислоты (глицина) и метионина данным методом рентабельно (в первом случае из-за отсутствия изомеров, во втором - вследствие равной терапевтической активности изомеров).

Химико-энзиматический метод проводят в 2 этапа. Сначала химически синтезируют предшественник аминокислоты, например карбоновую кислоту, а затем осуществляют биотрансформацию предшественника ферментами живых клеток. Таким путем можно получать, например, аспарагиновую кислоту на основе фумаровой или фенилаланин на основе коричной кислоты. Однако способ дорогой и сложный.

Микробиологический метод.

Обязательным условием возможности его использования является наличие штаммов-суперпродуцентов аминокислот. В качестве модельных микроорганизмов применяют некоторые штаммы Escherichiacoli, Bacillussubtilis, Corynebacteriumglutamicum. Критерии отбора биообъектов для создания промышленных штаммов. Прежде всего получение ауксотрофных мутантов, что предполагает использование только тех микроорганизмов, которые имеют разветвленный путь биосинтеза по крайней мере двух аминокислот, образующихся из одного предшественника. Их биосинтез контролируется на уровне первого фермента общего участка согласованным ингибированием конечными продуктами (ретроингибирование). Кроме того, в селекции продуцентов аминокислот активно применяют методы генной инженерии. Например, при вставке генов треонина в плазмиды для их клонирования значительно повышается количество ферментов, ответственных за биосинтез соответствующей аминокислоты. Особенностью питательных сред является добавление в ограниченном количестве той аминокислоты, биосинтез которой блокирован в результате мутагенного воздействия. Таким методом получают, в частности, глутаминовую кислоту, лизин, треонин.

                                                                           21-38

Задача 39.

Иммунобиотехнология как наука и производство, с одной стороны, предлагает средства для усиления

иммунной защиты организма в ответ на различные неблагоприятные факторы окружающей среды - вакцины,

сыворотки, рекомбинантные интерфероны, интерлейкины и другие цитокины, с другой стороны, путем

широкого применения моноклональных антител решает такие актуальные для фармации задачи, как

безопасность и контроль качества лекарственных препаратов.

Выберите иммунобиопрепараты для усиления иммунного ответа:

· пассивного специфического типа воздействия;

· пассивного неспецифического типа воздействия;

· активного типа воздействия.

Прокомментируйте возможности использования моноклональных антител при решении проблемы

безопасности ЛС (мониторинг ЛС).

ОТВЕТ:

Понятие «антиген» подразумевает определенную химическую структуру, против которой могут быть

получены антитела. Антигены внешней среды поступают в организм человека с воздухом, водой, пищей, через

слизистые оболочки и кожные покровы. Часть антигенов попадает в организм в виде вакцин и

иммуномодулирующих ЛС (агентов). Иммуномодуляторы либо усиливают, либо ослабляют иммунный ответ

организма. Иммунный ответ - сложный процесс межклеточного взаимодействия различных типов лимфоидных

клеток с участием специфических гормонов, вследствие которого В-клетки активно синтезируют специфические

антитела против данного антигена.

Антитела, однородные по структуре и специфичности, называют моноклональными антителами.

Способы усиления иммунного ответа по типу воздействия разделяют на активные и пассивные, а также

на специфические и неспецифические. Активную иммунизацию вызывают вакцины на основе рекомбинантных

протективных антигенов, живых гибридных носителей, выступающих в качестве иммунобиопрепаратов. В

формировании пассивного неспецифического иммунитета участвуют интерфероны, интерлейкины.

Поликлональные антитела к инфекционным агентам вызывают пассивный иммунитет и представлены

различными сыворотками. Сыворотки - это всегда готовые антитела.

По способу получения вакцины делят на живые вакцины с ослабленной вирулентностью и неживые

вакцины (молекулярные анатоксины - дифтерийный, столбнячный, ботулинический).

Живые вакцины могут быть как вирусного происхождения (например, для профилактики оспы, кори,

гриппа, краснухи, полиомиелита), так и бактерийного происхождения для профилактики сибирской язвы, чумы,

туберкулеза и др.

Существуют также комбинированные вакцины (поливакцины), состоящие из нескольких моновакцин,

например АКДС (дифтерийная, столбнячная, коклюшная).

Вакцина для профилактики полиомиелита является поливалентным препаратом из трех ослабленных

штаммов вируса полиомиелита.

В ответ на введение вакцины в организме человека или животного вырабатываются антитела к

патогенному микроорганизму, которые при последующей инфекции приводят к инактивации патогена, блокируя

его пролиферацию, что не позволяет развиться заболеванию.

Задача 40.

Иммунобиотехнология вносит весомый вклад в создание ЛС, профилактических и диагностических

препаратов. Однако не у всех людей и не всегда иммунная система обеспечивает защиту организма от различных

микробных и вирусных инфекций. Она может быть неадекватна внешним условиям, и иногда требуется помощь

в усилении иммунного ответа.

При анализе данной ситуации:

· сопоставьте виды и цели иммунизации с классификацией вакцин по способам их получения иприменению;

· свяжите атакующие агенты (ксенобиотики) с ответной реакцией организма, используя понятия«антиген», «антитело», «антигенные детерминанты» («эпитопы»), «гаптены»;

· прокомментируйте проявление иммунного ответа и способы его усиления.

ОТВЕТ:

Вакцины на основе рекомбинантных протективных антигенов, живых гибридных носителей как

иммунобиопрепараты вызывают активную иммунизацию посредством возникновения в организме человека или

животного антител, вызывающих блокировку пролиферации патогенного микроорганизма, что не позволяет

развиться заболеванию. Сюда относятся живые и аттенуированные вакцины, получаемые путем

культивирования штамма либо в курином эмбрионе, либо в других культурах животных клеток. Примером

дивергентной вакцины (с общим протективным антигеном у непатогенного для человека микроорганизма и с

патогенным для человека возбудителем инфекции) служит вакцина против натуральной оспы человека, в

которой использован непатогенный для человека вирус оспы коров. Кроме того, это и БЦЖ-вакцина (с

родственными в антигенном отношении микобактериями бычьего типа).

Далее можно отметить рекомбинантные вакцины (выделенный ген вируса вставляют с помощью вектора

в дрожжевую клетку или в клетку кишечной палочки), к примеру вакцина против гепатита В.

Кроме того, существуют комбинированные вакцины, в частности АКДС (дифтерийный, столбнячный

анатоксины и коклюшные корпускулярные антигены).

Неживые вакцины (инактивированные) включают в себя убитые культуры патогенных бактерий или

вирусов (цельноклеточные, цельновирусные вакцины) или комплексы из патогенных микробов с протективными

антигенами (субклеточные, субвирионные вакцины).

В молекулярных вакцинах антиген находится в виде фрагментов его молекул, определяющих

специфичность антигенности, т.е. в виде эпитопов, детерминант.

Задача 41.

Вакцины и сыворотки, как известно, применяют с целью профилактики или лечения. Вакцинация

способствует формированию у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам и тем самым защищает

его от инфекции. В случае введения сыворотки организм получает уже готовые антитела.

Сопоставьте вакцины и сыворотки как профилактические средства:

· по иммунному ответу;

· по способу получения и применению;

· по эффективности их использования.

ОТВЕТ:

Благодаря сыворотке организм человека защищен пассивным иммунитетом, соответственно, готовыми

антителами. В случае введения вакцины организм человека в ответ на полученный антиген сам вырабатывает

антитела. Для массового производства сывороток проводят иммунизацию домашних животных, например ослов

и лошадей. Очень важно, чтобы сыворотки, полученные таким путем, постоянно контролировали по такому

показателю, как титр антител у животных, и в момент взятия крови содержали бы максимальное количество

антител.

Технология получения сывороток, в отличие от вакцин, несложна. Вначале выделяют плазму крови,

потом удаляют из нее фибрин. Это один способ получения сыворотки.

Можно получать сыворотки из культивируемых животных клеток, однако здесь главной проблемой

является обеспечение стабильного роста животных клеток. Очень часто изолированные клетки животных просто

не делятся invitro. Именно поэтому для получения эффективного результата нужно, чтобы эти клетки

значительно преобладали в культуре, быстро адаптировались к новым условиям и быстро росли при полной

стерильности процесса и сред. Вода также должна быть стерильной.

Помимо этого существуют такие проблемы роста животных клеток, как генетическая нестабильность,

непостоянство генетических экспрессии, старение.

В качестве материала для культивирования можно использовать почки обезьян, собак, кроликов,

куриный эмбрион (14 дней).

Питательные среды должны содержать аминокислоты, белки, липиды, углеводы, витамины, глюкозу,

предшественники проста-гландинов, неорганические соли, микроэлементы. Температура культивирования

составляет +37 °С.

Консервируют посевной материал клеток (резервный фонд популяции) в жидком азоте при температуре

-196 "Св ампулах объемом 1 мл.

Процесс замораживания может иметь негативные последствия: образование кристаллического льда в

клетке, обезвоживание, повышение концентрации растворенных веществ, поэтому замораживание животных

клеток осуществляют в малых объемах (1 мл) с использованием криопротекторов, а скорость

замораживания/размораживания колеблется в строго определенных пределах.

Задача 42.

Известно, что главным компонентом иммунохимической реакции являются антитела

(иммуноглобулины), представляющие собой белки сыворотки крови, синтезируемые в организме человека в

качестве проявления защитной реакции (иммунитета) при попадании в него чужеродного вещества

(ксенобиотика).

Сопоставьте функции иммуноглобулинов (антител):

· с их классификацией и структурой;

· со схемой взаимодействия антигена с антителом, представлением о структуре антигена;

· с принципами расширения пределов чувствительности и повышения специфичностииммунохимических тестов.

ОТВЕТ:

Основной элемент структуры антител - четырехцепочечная молекула, состоящая из двух пар

идентичных полипептидных цепей: легких (L) и тяжелых (Н). Все цепи соединены дисульфидными связями. К

тяжелым цепям ковалентно присоединены олигосахаридные фрагменты. Различают 5 классов

иммуноглобулинов человека: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, полипептидные цепи которых образуют глобулярные

домены, состоящие из 110-115 аминокислотных остатков. Именно они и определяют биологические свойства

иммуноглобулинов. Вариабельные домены легких и тяжелых цепей образуют активный центр антител

соответствующей специфичности. Антитела формируются только к небольшим участкам на поверхности

молекулы белка, которые называются антигенными детерминантами и представляют собой выпуклые части

молекулы, которые могут входить внутрь активного центра антител. В случае бактериальных клеток такими

детерминантами служат короткие цепочки из 3-5 остатков Сахаров, образующих стенку бактерий.

Низкомолекулярные соединения, в частности лекарственные вещества, сами по себе не могут вызывать

образование антител. Такие соединения называют гаптенами. Однако если они присоединяются к

макромолекуле, организм начинает вырабатывать к ним антитела.

На первой стадии иммунохимической реакции происходит «склеивание» антигена и антитела, а вторая

идет с образованием комплексов сложного состава, что определяется помутнением раствора либо выпадением

осадка. Так, если в пробирку с раствором, содержащим постоянную концентрацию антител и меченого антигена,

добавить различные количества немеченого антигена, то концентрация комплекса антиген-антитело с меткой

будет обратно пропорциональна концентрации немеченого антигена. Для расширения пределов

чувствительности и повышения специфичности иммунохимических тестов в один из компонентов системы

вводят маркер, концентрацию которого можно легко определить.

Задача 43.

На сегодняшний день производство иммунодиагностикумов можно рассматривать как самостоятельную

область биотехнологической промышленности. Моноклональные антитела диагностического назначения,

получаемые с использованием гибридомной технологии, представлены широким ассортиментом наборов

фармацевтической продукции во всем мире. Иммунодиагностические тест-системы с использованием

поликлональных антител созданы практически для всех лекарственных препаратов.

Учитывая большой спектр использования иммунохимического анализа: - выберите наиболее важные

области его применения;

· представьте схему получения моноклональных антител;

· приведите пример использования тест-системы иммунохимического анализа в общей схемеэкспресс-анализа хорионического гонадотропина.

ОТВЕТ:

Самые важные области применения иммунохимического анализа - контроль банков крови, обнаружение

возбудителей во внешней среде, диагностика инфекционных заболеваний, диагностика диабета.

Иммунодиагностические тест-системы с использованием поликлональных антител созданы практически для

всех лекарственных препаратов, однако наиболее широко распространено использование моноклональных

антител, так как они являются практически чистыми реагентами, обладают стабильными характеристиками и

доступны в неограниченных количествах.

Схема получения моноклональных антител. Каким-либо синтетическим конъюгированным антигеном

иммунизируют мышей. Затем лимфоциты из селезенки мыши сливают с помощью ПЭГ с клетками стабильной

миеломной линии. Из полученных гибридных клеток отбирают только те, которые унаследовали от клеток

селезенки способность продуцировать антитела к ЛС, а от миеломных (опухолевых) клеток - способность к

неограниченному росту. Их культивируют и получают клон клеток, продуцирующих антитела к лекарственному

препарату. Этот клон прививают мышам для получения асцитных опухолей, и уже из асцитной жидкости

выделяют антитела.

При определении хорионического гонадотропина методом твердофазного ИФА на полистирольные

шарики сорбируют моноклональные антитела к хорионическому гонадотропину. К сенсибилизированным

шарикам добавляют исследуемую пробу (мочу) и конъюгат, состоящий из маркера и моноклональных антител к

другой детерминанте гормона. В результате иммунологической реакции хорионический гонадотропин

связывается одной детерминантой с моноклональными антителами, иммобилизованными на поверхности

шариков, а другой - с моноклональными антителами конъюгата с маркером (фермент пероксидаза). Затем

шарики отмывают от всех несвязавшихся компонентов мочи и определяют активность фермента в составе

иммунных комплексов с помощью субстратхромогенной смеси. Степень окраски раствора прямо

пропорциональна количеству хорионического гонадотропина в образце мочи