Применение иммобилизованных ферментов и белков В медицине открывает новые возможностисоздания эффективных лс.

Продемонстрируйте возможности и достоинства гидролаз при модификации таких широко применяемых антибиотиков, как пенициплины и цефалоспорины на основании:

· уникальных свойств гидролитических ферментов и определенных изменений в структуре данных антибиотиков, связанных с получением более эффективных аналогов;

· сравнения химического пути трансформации с биокаталитической технологией;

· производственных результатов получения этих антибиотиковкак целевых продуктов.

Ответ:

В отличие от химической трансформации биокатализ обладает уникальной специфичностью и избирательностью действия ферментов, возможностью проведения процесса в «мягких» условиях, высокой скоростью, использованием малых количеств катализаторов, практически полным отсутствием побочных реакций, что является несомненным преимуществом при создании лекарственных препаратов (антибиотики, стероиды, простагландины и т.д .). Гидролитические ферменты (гидролазы) нашли наибольшее применение в практике по следующим причинам:

· гидролитические реакции в водной среде, как правило, полностью термодинамически сдвинуты в сторону образования продуктов;

· кинетика реакций ферментативного гидролиза легко поддается количественному описанию до глубоких степеней превращения;

· гидролазы - наиболее изученные и наиболее легко управляемые ферменты;

· существует возможность оптимизации процессов по двум параметрам - концентрации расщепляемого субстрата и активности фермента;

· гидролазы избирательны по типу катализируемой реакции, проявляют широкую субстратную специфичность;

· гидролазы доступны в необходимых количествах (микроорганизмы содержат значительные количества различных гидролаз).

Возможности гидролаз можно представить при модификации пенициллинов и цефалоспоринов. Получение новых, более эффективных аналогов пенициллинов и цефалоспоринов связано с изменением боковой цепи при сохранении ядра антибиотика - 6-АПК или 7-АЦК как ключевых соединений для синтеза новых пенициллинов и цефалоспоринов. Например, после отщепления боковой цепи биосинтетического пенициллина и последующего ацилирования ее аминогруппы можно сравнительно легко получать его «полусинтетические» аналоги. Отщепление боковой цепи и превращение в 6-АПК с помощью фермента пенициллинамидазы можно провести в одну стадию при обычных условиях и температуре 10-40 °С в водной среде, избегая многостадийности, энергоемкости и больших объемов органических растворителей при химической трансформации, расщепив при этом более устойчивую амидную связ и сохранив более лабильную связь в β-лактамном кольце пенициллина.

Таким образом, переход к биокаталитической технологии существенно упрощает процесс, увеличивает выход целевого продукта и объем производства, стабилизирует процесс, делает его экологичным и снижает себестоимость. При получении новых полусинтетических цефалоспоринов также используют пенициллинамидазу, которая сохраняет целостность лабильного β-лактамного кольца.

Задача 18.

Несмотря на то что в основе современной инженерной энзимологии лежит применение ферментов и ферментных систем, технологическое использование ферментов имеет вполне конкретные ограничения: лабильность ферментов, дороговизна и большая трудоемкость при их очистке, однократность их использования, в ряде случаев наличие коферментов. Проанализируйте ситуацию с обоснованием:

· путей преодоления этих ограничений;

· сопоставления функции биообъекта с технологической операцией;

· понятия «система, открытая для усложнения».

Ответ:

Сравнительно недавно (несколько десятков лет назад) четко определились пути преодоления вышеуказанных трудностей. Эти пути связаны с получением иммобилизованных ферментов из клеток микроорганизмов. Сама иммобилизация представляет собой физическое разделение биообъекта (клетка, фермент) и растворителя, т.е. биообъект закреплен на нерастворимом носителе, а субстрат и продукты метаболизма свободно обмениваются между биообъектом и растворителем. Биообъект в этом случае работает многократно (недели, месяцы). Иными словами, иммобилизация ферментов - это перевод их в нерастворимое состояние с частичным или полным сохранением каталитической активности.

При совершенствовании биотехнологического процесса обычно используют следующие методы иммобилизации ферментов: ковалентное присоединение молекул ферментов к водонерастворимому носителю (природные- полимеры - целлюлоза, хитин, агароза; синтетические - поливинилхлорид, полиакриламид и др.); захват фермента в сетку геля или полимера;- - ковалентная сшивка молекул фермента друг с другом или с инертными белками;- адсорбция фермента на водонерастворимом носителе (часто на ионитах);-микрокапсулирование.-

В результате иммобилизации ферменты получают преимущества гетерогенных катализаторов: их можно удалять из реакционной смеси и отделять от субстрата и продуктов ферментативной реакции простой фильтрацией. Кроме того, появляется возможность перевода многих периодических ферментативных процессов на непрерывный режим с использованием проточных аппаратов или колонн с иммобилизованными ферментами. Что касается широко используемой иммобилизации целых клеток, то ее проводят аналогично, предотвращая размножение клеток, увеличивая их сохранность и срок работы в качестве катализатора. Примеры носителей органической природы: желатин, фибрин, альги-нат натрия, целлюлоза, ПААГ. Неорганические: термический песок, активированный уголь, окись алюминия, бентонит. Носитель не должен быть токсичным для биообъекта.

Ограничения использования иммобилизации возможны в 2 случаях: если целевой продукт не выходит в среду и если у фермента есть непрочно с ним связанный кофермент, без которого этот фермент не работает. Каждый из методов иммобилизации имеет свои ограничения, связанные с недостаточной прочностью получаемых связей. Особенно это касается микрокапсулирования (инкапсулирования). Ячейки геля не должны быть слишком маленькими (иначе возникнут трудности контакта фермента с субстратом и недостаточная аэрация). Однако и слишком большого размера ячейки геля быть не должны. В этом случае связь с гелем образуется слабая, и биообъект может вымываться.

Функции биообъекта связаны с технологической операцией определенным образом. Так, например, очищенный фермент, фермент в клетке с коферментом, фермент в пермеабилизированной клетке выполняют только отдельную реакцию: одноступенчатую трансформацию. Интактная клетка (клетка-продуцент) осуществляет полный биосинтез целевого продукта посредством цепочки реакций. Система, открытая для усложнения, - это клетка-продуцент какого-либо предшественника целевого продукта + первый фермент + второй фермент + третий фермент и т.д., т.е. биосинтез предпродукта и его биотрансформация осуществляются в одном биореакторе. Таким путем можно, в частности, одновременно получать 6-АПК, ампициллин и т.д.

Задача 19.

Витамины как группа незаменимых органических соединений различной химической природы необходимы любому организму в небольших концентрациях с целью выполнения в нем каталитических и регуляторных функций. С помощью биотехнологии сегодня можно получать в необходимых количествах такие витамины, как В2, В12, р-каротин*, витамин РР, эргостерин, аскорбиновую кислоту.