Каждая пробирка или флакон должны иметь маркировку, соответствующую номеру

животного, от которого получена проба. Образцы крови до исследования хранят при 4 - 8°С не

более 24 часов. Для более длительного хранения пробы должны быть заморожены при -20°С.

Выделение геномной ДНК.

В микроцентрифужную пробирку помещают 50 мкл крови и 250 мкл лизирующего

буфера. Смесь инкубируют 1 час при 56°С. Дважды экстрагируют равным объемом смеси

Фенол:хлороформ, третью экстракцию проводят равным объемом хлороформа.

Центрифугируют 10 мин при 12000 g. Отбирают супернатант, добавляют к нему 2,5 М ацетат

натрия, рН 5,2, до концентрации 0,25 М и два объема охлажденного 96% этанола. Раствор

выдерживают 30-40 мин при -20°С. Центрифугируют 10 мин при комнатной температуре.

Осадок промывают 600 мкл 70% этанола, центрифугируют 10 мин при 12000 g, подсушивают

Мин и растворяют в стерильной деионизированной воде в объеме, равном половине

Первоначального объема крови.

Выделение геномной ДНК можно проводить любым другим методом, позволяющим

Получить нуклеиновую кислоту, пригодную для амплификации в ПЦР.

Полимеразная цепная реакция

Выделенную ДНК амплифицируют в 25 мкл реакционной смеси следующего состава:

• р-рДНК         2-4 мкл

• 10х буфер ПЦР  2,5 мкл

• 2,5 mM MgCl2   5 мкл

• 10 mMdNTP      0,75 мкл

• праймеры         по 1 мкл каждого

• вода                    до 25 мкл

• Taq-полимераза   1 ед. акт.

Смесь набирают непосредственно перед амплификацией, прогревают 5 мин при 95°С,

Добавляют Taq-полимеразу и наслаивают 20 мкл минерального масла для предотвращения

Испарения.

Проводят 25-30 циклов амплификации в режиме:

• денатурация 30 с при 94°С;

• отжиг - 30 с при 48-65°С (температура подбирается опытным путем для каждой пары

праймеров);

• синтез 90 с при 72°С.

Если после 25-30 циклов реакции в пробе не обнаруживается специфический фрагмент

(анализ электрофорезом в агаровом геле), то отбирают аликвоту 2-4 мкл и переносят в новую

Пробирку, содержащую реакционную смесь с внутренними праймерами (так называемая

«nestecb-ПЦР) и проводят еще 25-30 циклов амплификации в том же режиме. Такая

Реамплификация позволяет увеличить как чувствительность, так и специфичность реакции.

Электрофорез в геле агарозы.

Анализ продуктов реакции проводят методом электрофореза в 2% агарозном геле.

Рассчитанное количество порошка агарозы и отмеренный объем 50 mM буфера для

электрофореза нагревают до полного растворения агарозы, остужают до 50-55°С, добавляют

Бромистый этидий до концентрации 0,5 мкг/мл и заливают гель, в который немедленно

Вставляют гребенку для получения в геле лунок для нанесения проб. Через 20-30 мин после

Того, как застыла агароза, гель помещают в камеру для электрофореза, наливают 50 mM буфер

Для электрофореза, наносят аликвоты реакционной смеси продуктов ПЦР, смешанные с

Буфером для нанесения проб, и проводят электрофорез при напряжении 100 В, пока

Бромфеноловый синий не пройдет 1,5-2 см от старта.

Учет результатов реакции.

Для идентификации специфического фрагмента используют стандартные маркеры -

Наборы фрагментов ДНК известной длины. При просмотре геля в ультрафиолете присутствие

Фрагмента определенного размера свидетельствует о наличии в пробе провирусной ДНК.

Гематологический метод исследования

Метод заключается в подсчете количества лейкоцитов в единице объема крови (1

Мкл) и качественной оценке лимфоидных элементов - лимфоцитов.

Гематологическому исследованию подвергают животных, в сыворотке крови которых

Серологическим методом (РИД, ИФА) обнаружены специфические антитела к ВЛКРС.

Объектом гематологического исследования являются периферическая кровь, пунктаты

Костного мозга, селезенки, лимфоузлов.

Гематологические исследования позволяют выявлять больных животных, а также

Проводить дифференциальную диагностику форм и стадий болезни.

Кровь для гематологических исследований берут из яремной вены в пробирки с