Выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью

Выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью

Полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Сущность метода.

Вирус лейкоза крупного рогатого скота присутствует в организме в виде ДНК-копий

(провируса), встраиваясь в геном клетки-хозяина. Это делает возможным выявление ВЛКРС с

Помощью современных молекулярно-биологических методов, в частности, методом

Полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для обнаружения провируса с помощью ПЦР

Используется геномная ДНК, выделенная из крови животных. В результате ПЦР определенный

Вирусоспецифический фрагмент выделенной ДНК амплифицируется (умножается) до

количества, достаточного для его визуального определения.

ПЦР представляет собой серию циклов, в течение которых происходит ферментативный

Синтез специфического участка нуклеиновой кислоты. Каждый цикл включает три этапа: при

нагревании до 94-95°С происходит разделение молекулы геномной ДНК на две

комплементарные цепи (денатурация); при охлаждении до 48-65°С с цепями ДНК соединяются

специфические олигонуклеотидные праймеры (отжиг); при нагревании до 72°С

Термостабильная ДНК-полимераза достраивает цепи ДНК, ограниченные парой праймеров

(синтез и элонгация). В результате реакции за один цикл количество специфического

Фрагмента ДНК увеличивается вдвое, и, в зависимости от количества циклов, можно получить

Более миллиона его копий.

Как диагностический метод ПЦР характеризуется высокой специфичностью, которая

Обусловлена выбором праймеров, и чувствительностью. С помощью ПЦР удается

Обнаруживать даже деградированную нуклеиновую кислоту, присутствующую в следовых

Количествах. Для проведения ПЦР-анализа достаточно 50 мкл крови, и результат может быть

Получен в течение рабочего дня. Метод ПЦР может использоваться для диагностики лейкоза

Крупного рогатого скота наряду с серологическими методами, а также в качестве

Подтверждающего теста.

Оборудование, расходные материалы и реактивы.

4.2.1. Оборудование:

• ДНК-амплификатор;

• Уф-трансиллюминатор;

• комплект приборов для горизонтального гель-электрофореза;

• микроцентрифуга (12000 g);

• термостат;

• холодильник;

• автоматические варипипетки (на 20, 200 и 1000 мкл).

4.2.2. Расходные материалы и посуда:

• пластиковые пробирки (0,5 мл и 1,5 мл);

• наконечники для пипеток;

• пенициллиновые флаконы или стеклянные пробирки.

Вся стеклянная посуда для ПЦР должна быть стерильна, а пластиковая - одноразового

Применения.

4.2.3. Реактивы и ферменты:

• фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (24: 24: 1, по объему);

• хлороформ: изоамиловый спирт (24: 1, по объему);

• агароза;

• Taq-ДНК-полимераза;

• специфические праймеры;

• этанол перегнанный 96% и 70%;

• минеральное масло;

• дистиллированная деионизированная автоклавированная вода.

4.2.4. Растворы и буферные смеси:

• цитратный буфер: 0,48% лимонная кислота; 1,32% цитрат натрия; 1,47% глюкоза;

• лизирующий буфер: 10 mM трис-HCl, рН 8,0; 10 mM этилендиаминтетрауксусная

кислота (ЭДТА), рН 8,0; 50 mM NaCI; 2% додецилсульфат натрия (SDS); протеиназа К в

концентрации 300 мкг/мл;

• буфер для ПЦР (10х): 50 mM KC1; 100 трис mM HC1; рН 9,0; 1% тритон Х-100;

• буфер для электрофореза (10х): 121,1 г трис; 51,35 г борная кислота; 3,72 г ЭДТА -

довести водой до 1 л;

• буфер для нанесения проб (6х): 0,25% бромфеноловый синий; 0,25% ксиленцианол;

40% сахарозы в воде;

• 10 mM dNTP (смесь всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов по 10 mM каждого);

• бромистый этидий, 10 мкг/мл;

• 25 mM MgCl2;

• 2,5 ацетат натрия, рН 5,2.

Этапы работы.

Отбор и хранение образцов крови.

Кровь для ПЦР-анализа берут из яремной вены крупного рогатого скота стерильной

Иглой с соблюдением правил асептики и антисептики. Для каждого животного пользуются

Отдельной иглой.

Образцы крови от животных отбирают в стерильные стеклянные пробирки или

Пенициллиновые флаконы, содержащие цитратный буферный раствор (1 часть раствора на 6

Частей крови). В качестве антикоагулянта может быть также использован раствор ЭДТА или

Выделение геномной ДНК.

Полимеразная цепная реакция

Выделенную ДНК амплифицируют в 25 мкл реакционной смеси следующего состава:

• р-рДНК         2-4 мкл

• 10х буфер ПЦР  2,5 мкл

• 2,5 mM MgCl2   5 мкл

• 10 mMdNTP      0,75 мкл

• праймеры         по 1 мкл каждого

• вода                    до 25 мкл

• Taq-полимераза   1 ед. акт.

Смесь набирают непосредственно перед амплификацией, прогревают 5 мин при 95°С,

Испарения.

Проводят 25-30 циклов амплификации в режиме:

• денатурация 30 с при 94°С;

• отжиг - 30 с при 48-65°С (температура подбирается опытным путем для каждой пары

праймеров);

• синтез 90 с при 72°С.

Учет результатов реакции.

Серологическим методом (РИД, ИФА) обнаружены специфические антитела к ВЛКРС.

Крови).

Х10 или 10х20.

Больших квадратах.

Для подсчета лейкоцитов применяют следующую формулу:

М*4000*Y

X=------------

  1600

где Х - количество лейкоцитов в 1 мкл крови;

М - количество клеток, подсчитанных в 100 больших квадратах;

Y - степень разведения;

4000 - объем малого квадрата;

Пример: В 100 квадратах подсчитано 256 клеток. Степень разведения крови 1:20.

Лейкоцитов в 1 мкл будет:

256*4000*20

X=---------------=12800

   1600

Отливать цветами радуги.

Нейтрофилов - розовый.

Романовскому-Гимза.

Выражают в процентах.

Отрицательным (-).

Таблица. Количество лейкоцитов и лимфоцитов в 1 мкл крови здорового,

Ключ»)

Возраст

Животного