Сучасні підходи до визначення змісту білка

 

Впродовж останніх років вітчизняна харчова промисловість розвивається вельми динамічно. Ця тенденція є, поза сумнівом, позитивною, тому що зумовлює формування зрілого внутрішнього ринку харчових продуктів, посилення конкуренції і, як наслідок, підвищення їх якості. Дійсно, при нагоді широкого вибору претендувати на споживчий попит може лише той товар, який відповідає високим вимогам якості. От чому останніми роками виробники продуктів харчування приділяють все більш пильну увагу питанням контролю за якістю сировини і кінцевого продукту, причому не тільки давно відомі, але і молоді підприємства, з перших ступенів розвитку тих, що дбайливо відносяться до своєї репутації.

Аналіз білка.

Одним з найважливіших показників якості продукції, що визначає її харчову цінність, є зміст білка. Класичним способом визначення білка є метод, розроблений ще в 1883 році датським хіміком Іоганном Кьельдалем, який надалі був названий його ім'ям. Це дуже трудомісткий і тривалий аналіз, і тому в сучасній лабораторній практиці метод Кьельдаля часто намагаються замінити альтернативними методами визначення білка, зокрема, з використанням дорогих програмно-апаратних комплексів. Але метод Кьельдаля, не дивлячись на його складність, дотепер залишається єдиним загальновизнаним арбітражним методом визначення білка, і найчастіше використовується як еталон для калібрування і настройки інших методик аналізу сировини і готової продукції. З цієї причини апарати для визначення білка по методу Кьельдаля є практично в кожній лабораторії по аналізу харчової продукції, а альтернативні методики застосуються тільки як допоміжні при дуже великій кількості щоденних аналізів. Для підприємства тільки початківця становлення своєї лабораторії, безумовно, переважним є саме метод Кьельдаля.

Метод Кьельдаля та рекомендоване обладнання.

Чому ж методу Кьельдаля, не дивлячись на більш ніж 120-річну історію, дотепер не знайдено гідної альтернативи? Причиною тому – висока специфічність вибраної реакції окислення білка сірчаною кислотою, в результаті якої руйнуються пептидні зв'язки в його молекулі і утворюються іони амонія, які в подальшому і можуть бути легко проаналізовані стандартними методами. Проте відтворюваність і точність методу Кьельдаля в істотному ступені залежить від досвіду аналітика. Прагнучи звести до мінімуму вплив людського чинника на результати аналізу, прискорити виконання методики і підвищити її безпеку, провідні виробники аналітичного устаткування розробили спеціалізовані комплекти устаткування для аналізу по методу Кьельдаля. Метод включає декілька основних етапів: відбір і підготовку проб, мокре озолення, отгонку з парою і визначення концентрації амонія (фотометрично або титриметрически). Для кожного етапу передбачені свої апаратні рішення, які в даний час фактично стали стандартом де-факто і практично повністю замінили дії, що виконуються лаборантом уручну.

Етап 1. Відбір і підготовка проб.

Необхідна умова отримання точних результатів аналізу по Кьельдалю – ретельна підготовка зразків. Процедура підготовки проб повинна забезпечувати гомогенізацію зразка, оскільки розмір частинок в аналізованих пробах не повинен перевищувати 1мм. Однорідність зразка підвищує відтворюваність методу, а також дозволяє зменшити об'єм проби. Зважування зразків для подальшого аналізу по Кьельдалю повинне проводитися на аналітичних вагах з точністю до 0,1мг., наприклад KERN ALS 120-4. Важливо знати вологість зразка. Для визначення змісту вологи рекомендується використовувати термогравіметричні аналізатори, такі як KERN MRS 120-3 або його аналоги, що мають погрішність на рівні 0,05-0.1%.

Етап 2. Мокре озолення.

Самим трудомістким і тривалим етапом в методі Кьельдаля є стадія мокрого озолення, в результаті якого відбувається повне «спалювання» зразка в сірчаній кислоті. У класичному приладі Кьельдаля на кожен грам зразка звичайно необхідно 25мл кислот і декілька годин для проведення розкладання, тоді як, наприклад, в блокових термореаторах серії DK (пр-ва італійської фірми VELP), завдяки підвищеній температурі розкладання (429 ⁰С) і оптимізації процесу термообробки, для розкладання одного грама речовини потрібний в середньому 30 хвилин і лише 10мл кислот. Термореактор DK дозволяє не тільки понизити витрату сірчаної кислоти, але і зменшити витрату гідроксиду натрію, використовуваного для подальшої нейтралізації разложивщегося зразка.

Етап 3. Отгонка з парою.

Одержаний після стадії розкладання прозорий розчин не годиться для безпосереднього визначення в ньому амонийного азоту з більшого змісту компонентів, що заважають. Для відділення амонійного азоту він переводиться в аміачну форму (додаванням лугу) і отгоняеться з парою на спеціальних приладах, званих дистиляторами. Компанія VELP, один з провідних виробників цього типу апаратів, придлагает декілька типів дистиляторів, що відрізняються рівнем автоматизації і функціональним наповненням: від простого UDK126D з ручним управлінням, який використовується при необхідності проведення декількох визначень білка в день, до повністю автоматичного програмованого UDK152 з вбудованим фотометричним титратором, продуктивність якого складає до 20 проб в годину і дозволяє повністю виключити участь оператора 3-їм і 4-му етапах аналізу.

Етап 4. Визначення змісту амонійного азоту.

Результати за визначенням білка прийнято представляти в мг/л амонійного азоту, тому метод визначення білка по Кьльдалю (що поширеніше в харчовій промисловості) часто ще називають методом визначення загального азоту по Кьельдалю. Перелічування на зміст білка здійснюється по відомому коефіцієнту, який в загальному випадку рівний 6.25, але може дещо відрізнятися для різних типів білка. Якщо щодня проводиться аналіз невеликої кількості проб, то можна задовольнятися звичайним бюреточним титруванням, але для титрування великої кількості проб і для підвищення точності результатів рекомендується використовувати автоматичні титратори. Хорошою альтернативою титриметрії може стати фотометричне визначення амонійного азоту за допомогою готових реактивів. Так компанія HACH-LANGE пропонує спектрофометры і фотометри серії DR, які комплектуються наборами реагентів, що дозволяють отримати результат за лічені хвилини. Наприклад, в пам'ять спектрофометра DR/2500 крім 5 різних методик визначення амонійного азоту і азоту по Кьельдалю, занесено ще більше 100 різних методів визначення цілого ряду металів, різних форм азоту і фосфору, практично всіх найважливіших аніонів.

Висновок.

В рамках цієї статті цілком усвідомлено не розглядалися інші методики визначення білка, оскільки всі вони вторинні і вимагають калібрування по методу Кьельдаля. Не дивлячись на складність комплексу устаткування, що здається, для визначення білка по Кьельдалю, використання саме цього методу аналізу, гарантує достовірність результатів, тоді як запропоноване приладове рішення дозволяє істотно збільшити відтворюваність, понизити витрату реактивів і забезпечити безпеку персоналу. Вказані моделі приладів характеризуються, перш за все, прийнятною ціною, високою надійністю і, головне, мають великий практичний досвід експлуатації на безлічі харчових виробництв в різних регіонах Росії, хоча для реалізації методу Кьельдаля звичайно можуть використовуватися прилади і інших виробників, вибір яких залежить від переваг і фінансових можливостей конкретної лабораторії.[12]