Общая схема исследования на фос

Подготовка объекта: измельчить

↓

Выделение:

1) настаивание с органическим растворителем (экстракция)

2) настаивание с водой, подкисленной серной кислотой, с последующей экстракцией.

↓

Очистка экстракта

↓

Получение сухого остатка

(водяная баня, ротационный испаритель)

↓

Растворение

↓

Исследования на ФОС:

1) предварительные,

2) подтверждающие,

)   количественное определение.

Характеристика некоторых методов изолирования

Препарат	Объект	Раствори- тель	рН	Кратность	Очистка	Растворение сухого остатка
Метафос	органы кровь	гексан (1:2) СНCl3 (1:1) гексан	2-3	1-2 ч + 1 ч 4ч +2ч+2ч	1) б\в Na2SO4 2)высушивание до V=20мл 3)экстракция ДМФА 4)ТСХ	1) гексан 2)ацетон
Хлорофос	органы кровь	вода+ Н2SO4 с экстракцией СНCl3 эфир, CHCl3	2-3	2ч+ 1ч +1 ч	1) б\в Na2SO4  2)высушивание на водяной бане	ацетон
Карбофос	органы кровь растительное сырье	бензол CHCl3 CCl4	1,0	1 ч х 5	1)фильтрование через б\в Na2SO4 2)высушивание при 60^0С 3)из загнившего -дополнительно очистка на Al2O3	10 мл этанола

 

Примечания:

Объект без глубокого гнилостного разложения - 1 - 3 дня хранения.

Количество исследуемого биоматериала: для изолирования метафоса - 25 гр., для изолирования хлорофоса и карбофоса - 20- 100 гр.

При исследовании крови ее берут из вены или артерии, добавляют гепарин, а затем исследуют.

Реакцию среды создают серной или соляной кислотой.

Доказательства наличия ФОС

. Предварительные исследования.

.Предварительная проба - холинэстеразная.

Носит отрицательное судебно-химическое значение.

Проба выполняется в трех чашках Петри, заполненных агар - агаром.

Первая - «холостой опыт». Содержит агар-агар, в лунку которого внесена капля ацетилхолина, капля сыворотки, содержащей ацетил-холинэстеразу и капля индикатора бромтимолового синего.

Вторая чашка - стандартная. Содержит те же компоненты, что и первая, но и каплю стандартного вещества - ФОС.

В третью чашку Петри с агар-агаром вносят компоненты, как и в первую, но добавляют каплю исследуемого экстракта.

После термостатирования цвет индикатора изменяется в чашках, где нет ФОС от синего к желтому.

Во второй чашке, где был стандарт и в третьей, если в исследуемом экстракте был ФОС цвет индикатора остается синим, так как ФОС блокирует холинэстеразу, ацетилхолин не разлагается и рН среды не изменяется.

Схема холинэстеразной пробы:

 

) АХ + АХЭ + ИНД (синий) → Холин + CH₃COOH + ИНД (желтый)

 

) АХ + АХЭ + ФОС + ИНД (синий) → АХ + ИНД (синий)

 

4) АХ + АХЭ + ЭКСТРАКТ + ИНД (синий) → АХ + ИНД

 

(цвет по наличию ФОС в экстракте)

Термостатирование при 38⁰- 40⁰С 30 минут.

Используемый индикатор - бромфеноловый синий.

Принцип:

Ацетилхолин при энзиматическом расщеплении ацетилхолинэстеразой, находящейся в сыворотке, образует холин и уксусную кислоту. Образующаяся CH₃COOH меняет реакцию среды на кислую и ведет к изменению цвета индикатора.

ФОС из исследуемого экстракта диффундирует в слой агар - агара, ингибирует фермент, ацетилхолин не расщепляется, реакция среды не меняется, цвет индикатора также не меняется.

Методика пригодна для биоматериала, хранящегося не более 5 дней при комнатной температуре. Продукты гниения угнетают активность холинэстеразы.

Поскольку ФОС обладают слабым ингибирующим действием in vitro, а при их окислении действие усиливается, то пробу проводят как с активацией бромом, так и без нее. Методика активации: к органическому извлечению добавляют бром, через 30 минут избыток брома удаляют 0,1 М раствором тиосульфата натрия.

Методика не специфична (дают ФОС и карбаматы). Однако, проста, наглядна, удобна при серийных исследованиях.

Определение фосфора после минерализации.

Минерализация действием сильных концентрированных кислот.

Фосфат - ион определяют молибдатом аммония в азотно- кислой среде - желтое окрашивание, после добавления восстановительной смеси (бензидин и гидроксид аммония) - синее окрашивание молибденовой сини;

ТСХ - в частных системах растворителей

Метафос

Система: хлороформ - н-гексан или бензол

Проявитель: раствор бромтимолового синего, содержащий серебра нитрат, термостатирование при 60⁰С 20 минут. Обработка уксусной кислотой. Пятна лилового цвета.

Хлорофос

Система: ацетон-н-гексан.

Проявитель: раствор резорцина и карбоната натрия - пятна оранжевого цвета, после термостатирования при 100⁰С 5 минут.

Карбофос

Система: ацетон-н-гексан

Проявитель: раствор бромтимолового синего, содержащий серебра нитрат, термостатирование при 60⁰С 20 минут. Обработка уксусной кислотой. Пятна лилового цвета.

. Подтверждающие исследования:

Метафос

. реакция Шенемана (действие 0-дианизидина и пербората натрия) - желтое или красноватое окрашивание.

. спектры в УФ - области.

Хлорофос

. с резорцином в щелочной среде - розовое окрашивание;

. проба Фудживара (с пиридином в щелочной среде)- розовое или красное окрашивание;

. с 2,4-динитрофенилгидразином - сине-фиолетовое окрашивание.

Карбофос

. с реактивом Марки - оранжевая окраска, переходящая в темно-коричневую.

. МКС реакция с хлоридом ртути. Наблюдают игольчатые кристаллы.

. МКС с реактивом Драгендорфа. Иглы темно-бурого цвета.

. реакция с диазотированной сульфаниловой кислотой в щелочной среде при нагревании, вишнево-красное окрашивание.

Количественное определение:

а) ГЖХ;

б) фотометрия на основе реакции образования молибденовой сини, для хлорофоса на основе реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.

Хлорорганические пестициды

1.Общая характеристика группы.

. Представители

. Токсичность.

. Пути метаболизма.

. Химико-токсикологический анализ.

 

Общая характеристика

Токсикологическое значение из хлорорганических пестицидов имеют 4 группы:

) ДДТ и его аналоги

) группа гексахлорциклогексана (ГХЦГ)

) полихлорциклодиены(ГПХ)

) токсафен и его производные

Группа ДДТ:

Название группы соответствует токсичному инсектециду дихлордифенилдихлорметилметану. Эмпирическая формула С₁₄Н₉Cl₅. С 1939г стали известны его инсектецидные свойства и началась эра синтетических органических пестицидов.

Токсичен и аналог ДДТ - метоксихлор.

Селективные инсектициды. ДДТ обладает нейро-, эмбрио-, иммунотоксичностью, мутагенным действием. Обладают способностью к кумуляции, долго сохраняются в природе. Производство и применение ДДТ в СССР запрещено с 1972 года, но его до сих пор можно найти на всех уровнях биосферы.