Морфология бактерий. Ультраструктура и химический состав бактериальной клетки. Сложные методы окраски.

 

Актуальность темы.

Как известно, бактерии и вирусы являются возбудителями многих инфекционных заболеваний. Знание основных групп бактерий и их функций, особенно токсигенных и патогенных свойств бактерий, поможет обучающимся правильно определять возбудителей различных заболеваний в патологическом материале, взятом от больного, для подтверждения диагноза, а также проводить интерпретацию полученных результатов.

Учебные цели:

­ изучить структуру бактериальной клетки; особенности химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий;

­ освоить методику сложных методов окраски: методы Грама, Циля-Нильсена, Нейссера и Бурри-Гинса,Ожешки.

 

Для формирования профессиональных компетенцийобучающиеся должны знать:

ü ультраструктуру и химический состав бактериальной клетки;

ü теоретические основы окрашивания микроорганизмов;

ü методику окраски бактерий по Граму;

ü методику окраски капсул бактерий по методу Бурри-Гинса;

ü методику выявления спор бактерий по методу Ожешки;

ü методику выявления зерен валютина по методу Нейссера;

ü методику окраски кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нельсена.

 

Для формирования профессиональных компетенций студент должен уметь:

ü обращаться с иммерсионной системой микроскопа;

ü готовить препараты из бактериальных культур;

ü произвести окрашивание микроорганизмов по методам Грама, Циля-Нильсена, Нейссера и Бурри-Гинса,Ожешки.

 

В результате освоения темы обучающийся должен владеть:

ü методами микроскопических исследований;

ü технику окрашивания микроорганизмов по методам Грама, Циля-Нильсена, Нейссера и Бурри-Гинса,Ожешки;

ü компетенциями:ОК-1, ОПК-7, ПК-1, ПК-3, ПК-13, ПК-18 и трудовыми функциями А/04.7, А/05.7, А/06.7.

 

3. Вопросы для самоподготовки к освоению данной темы

1) Структура бактериальной клетки: клеточная стенка. Различия в структуре грамположительных и грамотрицательных бактерий.

2) Протопласты и сферопласты, L-формы бактерий.

3) Структура бактериальной клетки: цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, капсула, нуклеоид, рибосомы, мезосомы, включения, ворсинки, жгутики.

4) Споры, их характеристики. Спорообразование.

5) Химический состав бактериальной клетки. Функции соединений, входящих в состав микробной клетки.

6) Механизмы взаимодействия красителей с цитоплазмой и отдельными структурами бактериальной клетки.

7) Сложные методы окраски: методы Грама, Циля- Нильсена, Нейссера и Бурри-Гинса, Ожешки.

4. Вид занятия: практическое занятие.

5. Продолжительность занятия: 3 часа (180 мин)

6. Оснащение:

6.1. Таблицы, готовые микропрепараты, предметные стекла, покровные стекла, пинцет, бактериологическая петля, спиртовка, спички, карандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипетки объемом 1 – 2 см³, дистиллированная вода, изотонический раствор хлорида натрия, иммерсионное масло, набор красок, культура бактерий.

6.2. Мультимедийные атласы, ситуационные задачи, таблицы (электронный вариант), видеофильмы.

6.3. Технические средства обучения: световые микроскопы, компьютеры, мультимедийный проектор.

 

7. Содержание занятия.

7.1. Контроль исходного уровня знаний и умений.

Выполнение тестовых заданий, собеседование.

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия.

Структура и химический состав бактериальной клетки. Механизмы взаимодействия красителей с цитоплазмой и отдельными структурами бактериальной клетки. Сложные методы окраски: методы Грама, Циля- Нильсена, Нейссера и Бурри-Гинса, Ожешки.

Метод Грама

Окраска по Граму является важным диагностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий. По способности окрашиваться красителями триметилфенолового ряда все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные. 

Способность грамположительных бактерий при окраске по Граму удерживать комплекс генцианвиолета с йодом связана со свойствами многослойного пептидогликана. Обработка спиртом вызывает сужение пор пептидогликана и тем самым задерживает краску. Наоборот, грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают краситель, обесцвечиваются и окрашиваются фуксином в красный цвет вследствие меньшего содержания пептидогликана, у них наиболее выражен липополисахаридный слой.

 

Метод Циля-Нильсена

Метод используется для окраски кислотоустойчивых бактерий (M. tuberculosis, M. leprae). Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной устойчивостью к неорганическим кислотам, спиртам и щелочам. Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке и цитоплазме бактерий повышенного количества липидов, воска и оксикислот, в частности миколовой кислоты. Карболовая кислота разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает тинкториальные свойства бактерий. Высокая концентрация красителя и нагревание усиливают реакцию взаимодействия клетки с красителями. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет.

 

Метод Нейссера

Некоторые бактерии способны накапливать фосфорную кислоту в виде гранул полифосфата (зерна волютина, метахроматические зерна, зерна Бабеша-Эрнста). Они играют роль фосфатных депо и регулярно выявляются у коринебактерий, микобактерий и спирилл в виде плотных, хорошо контурированных образований в форме шара или эллипса, располагающихся, в основном, у полюсов клетки. Обычно на полюсах бывает по одной грануле.

Метод Нейссера используется для выявления зерен волютина у возбудителей дифтерии (С. diphtheria). В отличие от других коринобактерий у возбудителей дифтерии зерна волютина располагаются на концах палочек.

 

Метод Бурри-Гинса

Некоторые виды бактерий продуцируют слизистое вещество, которое концентрируясь вокруг тела микробной клетки, образует капсулу. Капсула состояит из полисахаридов (пневмококк) или полипептидов (бацилла сибирской язвы).

Микрокапсулу (толщиной менее 0,2 мкм) способны формировать большинство бактерий, четко выраженную макрокапсулу (толщиной более 0,2 мкм) формируют пневмококк, клебсиеллы, возбудитель сибирской язвы и некоторые другие. У патогенных бактерий капсула образуется в макроорганизме, на искусственных питательных средах она обычно утрачивается (за исключением клебсиелл).

В организме человека и животных капсула защищает патогенные бактерии от бактериофага, фагоцитоза и гуморальных факторов иммунитета, определяет антигенную специфичность микроорганизмов.

Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают краситель.

Метод Бурри-Гинса используется для выявления у бактерий капсул. Капсула не воспринимает красители. Капсулу выявляют негативным контрастированием фона: тушь создает темный фон вокруг капсулы. 

 

Метод Ожешки

Этот метод служит для выявления у бактерий спор. Некоторые бактерии в конце периода активного роста способны образовывать споры. Этому предшествует обеднение среды питательными веществами, изменение ее рН, накопление ядовитых продуктов метаболизма. Как правило, одна бактериальная клетка образует одну спору. Споры имеют вид круглых или овальной формы образований, находящихся в теле микробной клетки. Различают три вида расположения спор по отношению к длинной оси палочки: центральное – спора находится в центре тела микроба (у сибиреязвенной бациллы), субтерминальное – спора расположена ближе к одному из ее концов (у возбудителей ботулизма, газовой гангрены), терминальное – спора располагается на конце палочки (у возбудителя столбняка).

 

7.3. Демонстрация преподавателем методики практических приемов по данной теме.

Преподаватель знакомит обучающихся с планом и методикой проведения практической работы.

 

7.4. Самостоятельная работа обучающихся под руководством преподавателя.

Задание 1

Окраска мазков по Граму

Приготовьте фиксированные препараты – мазки исследуемых культур стафилококка и кишечной палочки.

На фиксированный мазок положите фильтровальную бумагу, пропитанную генцианвиолетом и нанесите каплю воды на 2 минуты. Генцианвиалет – основная краска.

Через 2 минуты снимите фильтровальную бумагу и, не промывая водой, нанесите на мазок раствор Люголя на 1 минуту. Раствор Люголя – протрава, усиливает действие основной краски у грамположительных бактерий.

Слейте раствор Люголя с препарата, нанесите на мазок 3 – 5 капель этилового спирта и через 30 секунд быстро промойте водой. Спирт – обесцвечивающий фактор.

Нанесите на мазок водный фуксин Пфейффера на 1 – 2 минуты. Водный фуксин Пфейффера – дополнительная краска.

Препарат промойте водой, высушите фильтровальной бумагой и микроскопируйте под иммерсионным объективом.

При правильном окрашивании грамположительные бактерии (кокки) имеют сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные (палочковидные формы) розовый цвет.

Задание 2